对叶百部总生物碱对CHL细胞活性的影响.pdf

筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 192对叶百部总生物碱对CHL细胞活性的影响梁月铭，韦卫宁，何石燕，王孝勋*（广西中医药大学，南宁 530200）基金项目：广西壮瑶药重点实验室（桂科基字201432号）、壮瑶药协同创新中心（桂教科研201320号）、广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心（桂发改高技函20202605号）、广西中医药重点学科壮药学（GZXK-Z-20-64）、广西一流学科中药学（民族药学）（桂教科研201812号）第一作者：梁月铭，中药学学士，研究方向为中药品种、质量及资源开发*通讯作者：王孝勋，博士，研究员，硕士生导师，从事中药品种、质量及资源开发研究【摘 要】目的：探讨对叶百部总生物碱对中国仓鼠肺细胞CHL活性的影响。方法：以对叶百部总生物碱为指标成分，通过采用MTT比色法检测不同的含药浓度（10 g/mL、22g/mL、50g/mL、112g/mL、250g/mL）对CHL细胞存活的影响。结果：MTT比色法检测，在不同药液浓度（10 g/mL、22 g/mL、50 g/mL、112 g/mL、250 g/mL）干预CHL细胞24h后，与空白组比较，对叶百部总生物碱250g/mL及以下药液浓度对存活率均无显著差异（P0.05），说明对叶百部总生物碱浓度在250g/mL及以下对CHL细胞无明显毒性作用。结论：在本实验条件下，对叶百部总生物碱（10250g/mL）对中国仓鼠肺细胞株CHL细胞无明显的细胞毒性作用。【关键词】对叶百部总生物碱；CHL细胞；活性Effect of Stemona tuberosa Alkaloids on the activity of CHL cellsLiang Yueming，Wei Weining，He Shiyan，Wang Xiaoxun*（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200）【Abstract】Objective：Discussion on Stemona tuberosa Alkaloids of Chinese hamster lung cells the activity of chlorophyll.Methods：To Stemona tuberosa Alkaloids as an index of total alkaloid composition，by adopting determined by MTT colorimetry to detect different containing drug concentration（10，22，50，112，250 g/mL）.Results：MTT colorimetric detection，CHL cells were treated with different concentrations（10，22，50，112，250 g/mL）for 24 h，compared with the blank group，Stemona tuberosa Alkaloids 250 g/mL and below，concentration had no significant difference in survival rate（P0.05），The results showed that there was no obvious toxic effect on CHL cells when the concentration of total alkaloids was below 250 g/mL.Conclusions：Under this experimental condition，the Stemona tuberosa Alkaloids（10250 g/mL）of the Chinese hamster lung cell lines when no obvious cytotoxic cells.【Keywords】Stemona tuberosa Alkaloids；CHL cells；activity百部，性微温，味甘、苦，有小毒，来源于百部科（Stemonaceae）百部属植物直立百部Stemona sessilifolia（Miq.）Miq.、蔓生百部S.japonica（Bl.）Miq.、或对叶百部S.tuberosa Lour.的干燥块根作为正品百部入药。百部药材资源丰富，临床应用比较广泛，可用于医治润肺止咳、抗菌、抗炎等。对叶百部产量、蕴含量居百部属之首，是主流商品种类之一。对叶百部主要产于福建、湖北等省，是中华人民共和国药典收载的中药百部3个品种之一，其主要化学成分和活性成分为对叶百部总生物碱。现在关于对叶百部化学及药理成分作用研究虽多，但关于对叶百部总生物碱对CHL细胞的活性影响作用未见有研究报道。探讨对叶百部总生物碱对CHL细胞的活性影响作用，为对叶百部的深入研究提供实验依据。193对叶百部总生物碱对CHL细胞活性的影响1 仪器与试药1.1 实验仪器表1 实验仪器仪器型号厂家冷冻离心机185424R、5810R德国Eppendorf 公司洁净操作工作台SW-CJ-2FD苏州安泰空气技术有限公司CO2培养箱C170德国 Binder 公司电子天平BP310P德国 Eppendorf 公司倒置显微镜CKX53日本 Olympus 公司超纯水机Direct-Q5UV美国 Merck Millipore 公司制冰机M-F140AY65-PC日本 Panasonic 公司超低温冰箱MDF-U72V日本 SANYO 公司多功能酶标仪Filter Max F3美国 Molecular Devices 公司超微量紫外可见分光光度计DS-11美国 Denovix 公司1.2 细胞株本实验所用的CHL细胞购自于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库（编号：KCB200811YJ）。1.3 实验药物对叶百部生药材，2021年1月购自于广西百色市田林县高龙乡，该药材经广西中医药大学韦松基教授鉴定为百部科百部属植物，对叶百部（S.tuberosa Lour）的块根。药材粉末经紫外含量测定，测得其含量为86.22。1.4 实验试剂表2 实验试剂试剂批号厂家甲醇20210610国药集团化学试剂有限公司氯仿20210507国药集团化学试剂有限公司噻唑蓝（MTT）20210717北京索莱宝科技有限公司胎牛血清（FBS）21070703浙江天航生物科技股份有限公司0.25胰蛋白酶20169777江苏凯基生物技术股份有限公司RPMI-1640 培养液20210915江苏凯基生物技术股份有限公司二甲基亚砜（DMSO）RNBJ8185美国 SIGMA 公司磷酸盐缓冲溶液（PBS 液）20211017江苏凯基生物技术股份有限公司1.5 对叶百部总生物碱提取取对叶百部新鲜药材，放锅中并加入没过药材的水，水开沸腾1520 min，至药材切开呈透明状，无白心，即可。手工进行切片，厚度约47 mm，置于阳台自然风下晾干，粉碎。称取对叶百部药材粉末250 g（粉末已过24目筛），加入甲醇2 500 mL，称总重，保鲜膜封口，超声提取40 min；再次称定，用甲醇补重；减压抽滤，取过滤后的溶液于旋转蒸发仪中，挥干溶媒，回收甲醇，得到浸膏；往浸膏中加入1 250 mL的4盐酸溶液，充分搅匀；减压抽滤，得到酸水液，用NH3H2O溶液调节酸水液pH值至910；将溶液全部转移至分液漏斗中，加入1 000 mL氯仿，摇匀，静置，待分层后，取下层溶液，将溶液转移至水浴锅上挥干溶媒，即得对叶百部总生物碱浸膏。1.6 对叶百部总生物碱母液的配制与保存将对叶百部总生物碱浸膏用保鲜膜封口，放入-80 冰箱冷冻层过夜，第二天放入冷冻干燥机中冷冻成粉末。称取粉末2.5 g转移至离心管中，加入DMSO定容至10 mL，充分混匀，即得250 mg/mL的对叶百部总生物碱母液。母液可以密封好放置于-20 冰箱冷冻保存，使用前需要先融溶，再加入有血清RPMI-1640完全培养基，将母液配制至所需要的浓度即可。1.7 药液配制移取250 mg/mL的对叶百部总生物碱母液100 L，加入4 900 L含血清RPMI-1640完全培养基，充分混匀，过滤（0.22 m微孔滤膜），即得55 mg/mL对叶百部总生物碱药液，临用现配。MTT溶液配制：称取MTT粉末50 mg，加入10 mL磷酸盐缓冲溶液，稀释为5 mg/mL的储存液，采用0.22微孔滤膜对MTT溶液进行过滤，即得。分装至离心管中，避光，置于-20 冰箱冷冻保存，临用现溶。1.8 细胞培养试剂的配制及保存完全培养液的配制及保存：胎牛血清不完全培养液（已含双抗）=19，进行配制，混合均匀即得，配制后可放入4 冰箱中冷藏保存，备用。细胞冻存液的配制及保存：胎牛血清DMSO=91进行配制，混合均匀即得，配制后可放入4 冰箱中冷藏保存，备用。2 实验方法2.1 MTT法检测对叶百部总生物碱对中国仓鼠肺细胞CHL存活率取处于对数生长期的CHL细胞，倒置显微镜下观察细胞生长状况，贴壁吸弃细胞培养瓶原液，清洗2次，每次加2 mL磷酸盐缓冲溶液，轻缓清洗细胞；加入1 mL筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 194的0.25胰蛋白酶（含EDTA），拧紧瓶盖，为了利于消化，应轻轻晃动两下致使细胞培养瓶底均有溶液，放入37、5二氧化碳培养箱培养35 min；观察细胞变钝变圆、能漂浮起来，则加入2 mL新鲜配制的完全培养液，终止细胞的消化，并且吹打至均匀，用新鲜配制的完全培养液稀释至细胞浓度计数为2105个/mL；取100 L按设计培养规格接种至96孔板中，重复6个复孔，另设6孔为调零孔，仅加200 L不含细胞的新鲜配制完全培养液，剩余孔全加入200 L的磷酸盐缓冲溶液；常规培养24 h后，含细胞孔将贴壁吸弃原培养液，更换新鲜配制的含药完全培养液，每孔加200 L，对叶百部总生物碱终浓度分别为10、22、50、112和250 g/mL，另设6孔为空白孔，每孔仅加200 L新鲜配制的完全培养液；常规培养24 h后，每孔加入20 L浓度为5 mg/mL的MTT溶液（操作过程需避光）；常规培养4 h后，贴壁吸弃细胞培养瓶原液，每孔加入100 L的二甲基亚砜，将96孔板置于酶标仪中，设置波长为570 nm，温度为37，振荡时间为10 min，进行摇匀，检测细胞吸光度（OD值），并计算细胞存活率（）。细胞存活率（）=100（给药组OD值-调零组OD值）/（空白组OD值-调零组OD值）1。2.2 统计分析采用Microsoft Excel整理数据，SPSS 17.0软件进行分析。结果以xs表示，当P0.05认为差异有统计学意义。3 实验结果在本实验中，采用MTT法检测对叶百部总生物碱对CHL细胞存活率的影响，以此来确定药物干预浓度。分别用0、10、22、50、112、250 g/mL的对叶百部总生物碱干预CHL细胞，24 h后，检测CHL细胞的存活率。结果与空白组比较，对叶百部总生物碱250 g/mL及以下，细胞暴露终浓度对CHL细胞作用24 h后细胞存活率均无显著差异（P0.05），说明对叶百部总生物碱250 g/mL及以下细胞暴露终浓度对CHL细胞无明显毒性作用。4 讨论MTT比色法2，3是一种常用于检测细胞存活和生长的方法，MTT是琥珀酸脱氢酶的一种底物，淡黄色，其分子中的四氮唑环在活细胞线粒体酶的作用下复原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，二甲基亚砜（DMSO）能溶化细胞中的甲瓒结晶，用酶标仪在570 nm波长处测定其吸光度值（OD值），可间接反映活细胞数量，测定的OD值越大，表明活细胞数越多。实验中，用10 g/mL、22 g/mL、50 g/mL、112 g/mL和250 g/mL浓度的对叶百部总生物碱药液干预CHL细胞，发现对叶百部总生物碱各浓度对CHL细胞作用24 h后细胞的存活率均无显著差异，说明对叶百部总生物碱250 g/mL及以下细胞暴露终浓度对CHL细胞无明显毒性作用。参考文献1翟江云，张斌，郭佳维.那可丁联合奥沙利铂对人舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞增殖及凋亡的影响J.中国现代医学杂志，2020，30（14）：7-12.2曹芳.抗氧化剂对铀矿尘致人巨噬细胞功能损伤的保护作用D.湖南：南华大学，2014.3梁荔，盛红光，刘雯，等.MAPKs 信号转导通路在 DHA 诱导胃癌细胞凋亡中的作用J.中国现代普通外科进展，2009，12（12）：1 026-1 029.