基于“抗氧化作用-活性成分”关联的桑椹等级评价研究.pdf

筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 142基于“抗氧化作用-活性成分”关联的桑椹等级评价研究谭丽芳1，2，吴剑丽2，覃慧玲2，王剑2，马雯芳2*，孙振华2，张秀丽2，林春榕2，钟珍林2（1.桂林市中医医院，桂林 541002；2.广西中医药大学 药学院，南宁 530200）基金项目：广西自然科学基金（2020GXNSFAA159145）；广西壮瑶药重点实验室（No.桂科基字201432号）；壮瑶药协同创新中心（No.桂教科研201320号）；广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心（桂发改高技函20202605号）、广西中医药重点学科壮药学（GZXK-Z-20-64）；广西一流学科建设项目（2018XK032）；广西一流学科建设开放课题（2019XK098）；大学生创新创业训练计划项目（S202210600061）；广西中医药大学研究生教育创新计划项目（YCXJ2021016）第一作者：谭丽芳，学士，主管中药师，从事中药品质评价研究*通讯作者：马雯芳，博士，教授，从事中药品种鉴定与品质评价研究【摘 要】目的：基于“成分反映活性，活性指向功效”的研究思路，建立药食两用品桑椹等级评价二分类Logistic模型，为桑椹质量等级划分提供参考。方法：采用HPLC法测定桑椹中抗氧化活性成分原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素的含量，采用FRAP法从总还原能力方面评价桑椹抗氧化活性，运用Logistic回归分析法，将原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素含量指标和抗氧化活性指标进行关联分析，建立用于桑椹质量等级划分的二分类Logistic回归预测模型。结果：根据Logistic回归分析预测模型，50个批次的桑椹分布在优级有26个批次、良级有9个批次、中级有15个批次。结论：基于Logistic回归模型建立的桑椹质量等级评价模型，可用于桑椹质量的等级划分预测，为桑椹质量评价提供新的参考。【关键词】桑椹；等级评价；Logistic回归；含量测定；抗氧化Study on the mulberry grade evaluation based on the“antioxidant action-active ingredient”associationTan Lifang，Wu Jianli，Qin Huiling，Wang Jian，Ma Wenfang*，Sun Zhenhua，Zhang Xiuli，Lin Chunrong，Zhong Zhenlin（1.Guilin Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guilin 541002；2.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200）【Abstract】Objective：Based on research approach of ingredients reflects activity，and activity points to effect，to establish a two-class logistic model for grade evaluation of mulberry using for medicinal and edible products，which provides a new reference for mulberry quality evaluation.Methods：HPLC method was established for the determination of protocatechuic acid，chlorogenic acid，rutin，hyperoside and quercetin in mulberry，FRAP method was used to evaluate the antioxidant activity in terms of total reducing capacity，using logistic regression analysis，the contents of protocatechuic acid，chlorogenic acid，rutin，quercetin and antioxidant activity were correlated.A two-class Logistic regression prediction model was established for the classification of mulberry quality grade.Results：Based on the Logistic regression model，there are 26 batches of mulberry in excellent grade，and 9 batches in good grade，15 batches in madium grade.Conclusion：Mulberry quality rating evaluation model based on logistic regression model，which can be used to grade the quality of mulberry，and provides a new reference for mulberry quality evaluation.【Keywords】Mulberry；grade evaluation；Logistic regression；content determination；antioxidant桑椹是桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗，具有滋阴补血，生津润燥的功效，现代药理学研究表明，桑椹具有抗氧化、免疫调节、降血糖、降血脂等广泛的药理作用1-5，抗氧化作用尤为突出6-10。本研究采用HPLC法测定桑椹内在活性成分原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素的含量，并采用FRAP法从总还原能力方面进行抗氧化活性测定，将药效活性成分和抗氧化活性相结合，从化学成分及药理活性两个维度立体评价桑椹的143基于“抗氧化作用-活性成分”关联的桑椹等级评价研究品质，结合化学计量学方法采用主成分分析（PCA）和多因素Logistic回归分析模型，建立“抗氧化作用-活性成分”关联的桑椹药材质量等级评价模型，为桑椹品质等级评价预测提供了新思路。1 材料与方法1.1 材料与试剂从各地采集或购买桑椹50批，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥果穗。药材信息见表1。表1 桑椹药材信息表编号购买地编号购买地编号购买地编号购买地S1广西南宁1S14广西南宁14S27重庆S40陕西西安S2广西南宁2S15广西南宁15S28四川巴中S41湖南长沙1S3广西南宁3S16广西南宁16S29四川凉山1S42湖南长沙2S4广西南宁4S17广西北海S30四川凉山2S43湖北武汉S5广西南宁5S18广西桂林S31广东汕头S44河北石家庄S6广西南宁6S19广西玉林1S32广东中山S45河北沧州S7广西南宁7S20广西玉林2S33广东广州1S46江西南昌S8广西南宁8S21四川攀枝花S34广东广州2S47黑龙江哈尔滨S9广西南宁9S22四川成都1S35福建漳州S48浙江安吉S10广西南宁10S23四川成都2S36江苏盐城1S49浙江衢州S11广西南宁11S24四川成都3S37江苏盐城2S50云南大理S12广西南宁12S25四川成都4S38山东济南S13广西南宁13S26四川成都5S39山东泰安原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素（纯度均98，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪TPTZ（分析纯，Solarbio公司）；硫酸亚铁（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）；盐酸（分析纯，廉江市爱廉化学试剂有限公司）；甲醇、乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；FeCl36H2O，冰醋酸钠（分析纯，成都金山化学有限公司）。1.2 仪器与设备e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；UV2600紫外可见光分光光度计（日本岛津科技有限公司）；CR-SP412超纯水仪（HealtForce）。1.3实验方法1.3.1 含量测定1.3.1.1 色谱条件选用Agilent 5 TC-C18（4.6250 mm，5 m）为色谱柱，以乙腈-0.1磷酸为流动相，洗脱程序为：013 min，1120（乙腈）；1330 min，2033（乙腈）；3038 min，3333（乙腈）；检测波长：09.5 min，256 nm；9.517 min，325 nm；1738 min，256 nm。色谱柱温度为25，流速为1.0 mLmin-1。1.3.1.2 混合对照品溶液的制备分别称取原儿茶酸、绿原酸、芦丁和槲皮素对照品适量，用50乙醇定容至10 mL容量瓶中，分别制成浓度为0.027 4 mgmL-1原儿茶酸0.096 0 mgmL-1绿原酸、0.067 1 mgmL-1芦丁和0.003 5 mgmL-1槲皮素的混合对照品溶液，备用。1.3.1.3 供试品溶液的制备取本品粉末1.0 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入50乙醇30 mL，超声提取40 min。1.3.1.4 系统适应性实验按1.3.1.3项下的方法制备供试品溶液，依据1.3.1.1项下色谱条件进样检测后，记录分析色谱图。1.3.1.5 线性关系考察精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10，12 L，按1.3.1.1项下色谱条件进样检测，记录各对照品的峰面积。以进样量（g）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。1.3.1.6 精密度试验吸取1.3.1.2项下混合对照品溶液10 L，按1.3.1.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。1.3.1.7 稳定性试验精密称取同一批桑椹药材（S7）1.0 g，按1.3.1.3项下条件制备供试品溶液，于制备后的0、2、4、8、12、24 h按1.3.1.1项下色谱条件进样检测，记录色谱图。1.3.1.8 重复性试验精密称取同一批桑椹药材（S7）1.0 g，6份，按1.3.1.3项下条件制备供试品溶液，按1.3.1.1项下色谱条件进样检测，记录色谱图。筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 1441.3.1.9 加样回收率实验精密称定0.5 g桑椹药材（S7），精密移入原儿茶酸、绿原酸、芦丁和槲皮素对照品适量，按照1.3.1.3项下方法制备供试品溶液，按1.3.1.1项下色谱条件进样检测，计算加样回收率以及RSD值。1.3.1.10 含量测定称取50个批次不同桑椹药材各1.0 g，各3份，按1.3.1.3项下条件制备供试品溶液，按1.3.1.1项下色谱条件测定。1.3.2 抗氧化生物活性测定1.3.2.1 FeSO4标准曲线绘制将浓度为10 mmolL-1的FeSO4溶液分别稀释成2、4、6、8 mmolL-1的FeSO4溶液。取不同浓度的FeSO4溶液20 L，分别与4 mL FRAP工作液（20 mmolL-1的FeCl3溶液，0.3 mmolL-1的醋酸钠溶液，40 mmolL-1的稀盐酸溶液，10 mmolL-1的TPTZ溶液按体积比1011混匀）避光反应40 min，于596 nm波长处测定吸光度值。1.3.2.2 FRAP测定抗氧化活性精密称取不同批次桑椹药材各0.3 g，加入50乙醇30 mL，超声提取40 min，取上清液20 L加入4 mL FRAP工作液中，避光静置40 min，于596 nm处测定吸光度值。1.3.3 桑椹等级分类预测采用FRAP法从总还原能力方面评价桑椹抗氧化活性，采用HPLC法测定原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4个具有抗氧化活性成分的含量。本文以各个批次数据测定结果作为模式识别的基础，采用Logistic回归模型对不同批次桑椹等级进行预测评价。1.3.3.1 主成分分析将不同批次桑椹中的原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种成分测定得到的数据进行对齐、积分、标准化处理后，导入Simca-p14.1软件，并以影响因素作为观测值进行主成分分析（PCA）。1.3.3.2 Logistic模型建立根据上述的分类结果，对不同等级的样本进行赋值，优、良、中分别赋值为3、2、1。用X1、X2、X3、X4、X5分别表示原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素、FeSO4当量的含量，通过利用SPSS19.0进行二分类Logistic回归模型参数的估计，得到优、良、中3种不同等级样品概率预测的模型表达式。2 结果与分析2.1 含量测定2.1.1 系统适应性结果表明，各组分色谱峰的分离度均1.5，理论塔板数均6 000，符合含量测定要求。混合对照品及样品的高效液相色谱图见图1图2。2.1.2 线性关系考察线性关系考察结果见表2。图1 桑椹供试品色谱图1.原儿茶酸 2.绿原酸 3.芦丁 4.槲皮素图2 混合对照品色谱图1.原儿茶酸 2.绿原酸 3.芦丁 4.槲皮素145基于“抗氧化作用-活性成分”关联的桑椹等级评价研究表2 标准曲线方程成分线性方程相关系数线性范围（g）原儿茶酸Y=3.63106 X1-4.071040.999 90.054 80.329 0绿原酸Y=3.35106 X2+1.21050.999 60.191 91.151 芦丁Y=1.94106 X3-5.411040.999 90.134 30.805 6槲皮素Y=4.18106 X5-6.411030.999 90.006 90.041 62.1.3 精密度试验精密度试验结果显示，原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种成分的RSD依次为1.62、0.17、0.33、0.39，表明仪器精密度良好。2.1.4 稳定性试验稳定性试验结果显示，原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种成分的RSD分别为1.02、0.86、0.34、0.50，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.1.5 重复性试验重复性试验结果显示，原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种成分RSD分别为0.45、0.65、0.65、0.36，表明该方法重复性良好。2.1.6 加样回收率实验加样回收率试验结果显示，原儿茶酸、绿原酸、芦丁和槲皮素平均回收率分别为99.98、102.09、101.28、100.12，RSD值分别为2.20、2.23、2.17、2.11。2.1.7 含量测定不同批次桑椹中原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种活性成分的含量测定结果见表3。2.2 抗氧化活性测定2.2.1 FeSO4标准曲线绘制以FeSO4浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，最终得到标准曲线方程：Y=0.105 690X+0.145 690，r2=0.99 985。2.2.2 抗氧化活性测定不同批次桑椹FeSO4当量为28.41185.74 mgg-1，结果见表4。表3 不同批次桑椹4种化学成分含量测定结果批号含量（mgg-1）原儿茶酸绿原酸芦丁槲皮素S11.046 917.185 510.702 40.201 5S20.504 16.713 68.747 60.069 5S34.978 210.124 411.154 70.353 2S42.778 43.715 610.010 20.206 9S56.695 37.001 317.904 50.452 0S62.633 07.188 79.132 30.159 2S70.729 54.194 61.613 80.092 5S82.775 24.194 63.689 00.167 5S94.129 50.475 96.104 60.475 2S102.833 70.217 79.206 20.175 1S111.823 52.284 82.520 70.094 8S121.440 36.830 02.410 40.102 0S135.550 40.450 64.566 60.319 6S144.318 86.858 55.071 80.208 2S153.749 21.263 69.292 10.387 7S164.884 44.291 24.955 50.229 5S175.327 53.692 09.561 20.382 8S182.745 70.060 23.279 10.271 3S222.087 55.425 83.173 40.256 2S234.289 20.382 85.177 40.220 2S244.129 53.682 26.104 60.475 2S252.796 24.596 03.589 50.215 5S262.087 52.219 93.173 40.256 2S283.845 21.299 59.076 60.317 9S293.376 72.662 67.382 00.268 5S302.900 60.272 29.626 60.210 9S313.689 01.742 94.465 00.296 6S324.136 02.392 29.355 00.440 0S333.435 10.172 88.668 90.275 6S345.257 83.304 811.784 90.289 9S353.995 915.571 07.713 30.239 2S363.928 93.495 96.264 80.227 2S373.362 24.996 27.667 20.310 8S380.924 50.359 21.717 60.123 7S392.850 50.521 89.253 00.176 8S401.278 93.677 81.118 40.069 9S411.539 03.361 85.299 60.398 8S423.056 10.051 68.892 70.237 1S431.204 57.820 62.831 80.107 7S442.649 56.443 85.352 60.153 6S451.347 41.972 63.125 10.126 3S462.895 21.299 52.569 90.233 6S475.941 22.227 28.544 00.350 4S480.638 12.642 71.052 70.111 8S492.681 91.255 36.764 10.284 9S501.404 94.368 72.257 80.099 6筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 146表4 不同批次桑椹药材抗氧化活性测定结果编号FeSO4当量（mgg-1）编号FeSO4当量（mgg-1）编号FeSO4当量（mgg-1）编号FeSO4当量（mgg-1）S129.368S14118.918S2782.101S4092.935S215.466S15110.865S2891.881S4149.023S3105.591S16120.932S29132.054S4241.928S4106.454S17153.147S30182.677S43103.098S5139.82S1837.23S3192.84S4428.41S653.625S1938.381S3271.842S4592.264S720.548S2063.405S33123.904S4638.764S848.16S2183.923S3422.945S4767.815S9107.701S2248.832S3553.53S4815.562S1064.268S2334.929S3638.477S4947.585S1196.675S24107.029S3756.406S5047.202S1249.311S25115.179S38112.494S13133.3S26116.425S3967.3362.3 桑椹等级分类预测2.3.1 主成分分析将提取的数据进行数据对齐、积分、标准化处理后，导入Simca-p14.1软件，以影响因素（原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种化学成分和抗氧化活性FeO4当量测定结果）作为观测值进行主成分分析。从得到的数据矩阵中提取携带差异变量最多的主成分。由相关系数矩阵R得到特征值、方差贡献率（R2Y）和累积方差贡献率。模型自动拟合2个主成分，累计的贡献率为80.7，即从原始数据中提取了80.7的信息。以前2个主成分建立投影，得到散点图，可以看出50批药材大致分布在不同的象限，可以进行初步的桑椹药材分类。利用系统聚类法对各批数据进行聚类分析，由图4可见，各等级间有明显的分类距离，分为三类。从图5中可以看到，S1、S31、S49、S6、S40、S50、S2、S12、S39归为一类，S34、S46、S48、S7、S36、S44、S8、S19、S22、S47、S18、S42、S41、S11、S23被归为另一类，剩下的26批被归为第三类。结果表明，图4、图5的分类结果一致，结果具有较高的可靠性。图3 模型预测图图4 PCA散点图2.3.2 Logistic模型建立根据上述的分类结果，对不同等级的样本进行赋值，优、良、中分别赋值为3、2、1，根据聚类分析的结果，优等级的药材有26批，良等级的有9批，中等级的有15批。用X1、X2、X3、X4、X5分别表示原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素、FeSO4当量的含量，利用SPSS19.0统计软件进行二分类logistic回归模型参数的估计，可以得到优、良、中3种不同等级样品概率预测的模型表达式为：将各化学成分指标和抗氧化指标实测值代入各式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定桑椹药材的等级。共46批药材拟合概率大于0.99，2批（S8、S19）拟合概率分别为0.67、0.75，2批（S22、S47）拟合概率分别为0.35、0.37，Logistic回归模型对上述样本的拟合结果与实际结果基本一致，说明其可以很好地表达等级分类标准，各等级分类结果及概率见表5。3 结论与讨论在大健康背景下，近年来抗氧化作用研究成为了热点，对从天然产物尤其是药食两用的物质中寻找抗氧化剂的研究越来越受到重视。桑椹是药食两用之品，其口感良好且具有良好的抗氧化活性，是深受喜爱的抗氧化物质。本文采用FRAP法从总还原能力方面对桑椹的抗氧化作用进行评价。本实验在单因素考察的基础上结合L9（34）正交试验法，对供试品溶液制备方法进行考察，选择提取溶剂（30乙醇、50乙醇、70乙醇）、溶剂用量（20 mL、25 mL、30 mL）、提取时p3=exp（-164.228+9.963X1-5.243X2+8.543X3+249.515X4+0.684X5）1+exp（-164.228+9.963X1-5.243X2+8.543X3+249.515X4+0.684X5）p1=exp（32.060-2.602X1-2.206X2-1.781X3-10.523X4-0.136X5）1+exp（32.060-2.602X1-2.206X2-1.781X3-10.523X4-0.136X5）p2=exp（-49.778-19.824X1+14.489X2+4.457X3-371.378X4+0.617X5）1+exp（-49.778-19.824X1+14.489X2+4.457X3-371.378X4+0.617X5）147基于“抗氧化作用-活性成分”关联的桑椹等级评价研究间（20 min、30 min、40 min）为考察因素，以原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种活性成分含量为评价指标，优化桑椹药材中抗氧化活性成分的提取工艺，最终确定以50乙醇30 mL超声提取40 min为桑椹中原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素4种抗氧化活性成分的最佳提取方法。表5 不同来源桑椹等级分类结果等级编号概率等级编号概率等级编号概率3S31.003S291.002S501.003S41.003S301.001S71.003S51.003S321.001S80.673S91.003S331.001S110.983S101.003S351.001S180.993S131.003S371.001S190.753S141.003S381.001S220.353S151.003S431.001S230.993S161.003S451.001S340.993S171.002S11.001S361.003S201.002S21.001S410.993S211.002S61.001S420.993S241.002S121.001S441.003S251.002S311.001S460.993S261.002S391.001S470.373S271.002S401.001S480.993S281.002S491.00从桑椹主产区收集的50个不同批次的桑椹，受种植品种、产地、采收时间等因素影响，有机酸、黄酮类成分（原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素）的含量有较大差异，其含量与体外抗氧化活性未建立线性关系。桑椹具有多种化学成分类型，除含有有机酸、黄酮类成分外，还含有丰富的氨基酸、多糖等成分。桑椹发挥抗氧化活性除了有机酸、黄酮类成分（原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素）发挥作用外，还是多种成分共同发挥作用的结果，仅通过采用HPLC法测定个别化学成分含量难以全面客观反映桑椹药材的品质。本文将影响桑椹品质的主要活性成分原儿茶酸、绿原酸、芦丁、槲皮素含量与抗氧化作用相关联，建立“内在成分-活性效价”关联的二分类Logistic回归分析桑椹等级评价模型，用于桑椹质量的等级划分预测。50个不同批次的桑椹共分为优、良、中3个等级，分布在优级有26个批次、良级有9个批次、中级有15个批次，为桑椹品质等级划分及质量评价提供新的研究思路和参考，为桑椹的进一步开发利用提供依据。桑椹除含有有机酸、黄酮成分外，还含有多糖、氨基酸、花色素等多种成分类型，桑椹抗氧化作用是多种成分综合发挥作用的结果，桑椹各化学成分如何协同发挥作用及其作用机制有待进一步研究。参考文献1蔡毅，孙振华，马雯芳，等.基于自由基清除能力的桑椹活性成分群提取工艺优选及活性评价J.食品研究与开发，2020，41（12）：130-134.2刘学铭，黄小霞，廖森泰，等.3种富含花青素植物提取物抗氧化和降血脂活性比较研究J.中国食品学报，2014，14（1）：20-27.3王瑞坡，王珂，李姣，等.桑椹乙酸乙酯萃取物对链脲佐菌素致高血糖大鼠的降血糖作用J.中成药，2011，33（10）：1 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