虫草素及其代谢物3′-脱氧肌苷在大鼠体内的药动学.pdf

.():.冯慧周婷婷黎子文等.常春藤皂苷调控 介导的谷氨酰胺代谢抑制肠上皮细胞恶性转化研究.中草药():.陈永孜杨丽雯李强等.新一代测序技术在抗癌药物精准治疗中的研究现状.医药导报():.():.:.():.():.():.():.(/):.():.王子锡.基因在肝癌发生中的作用新进展.右江医学():.施明王福生刘明旭等.、及 细胞 基因突变检测.世界华人消化杂志():./.():.:.虫草素及其代谢物 脱氧肌苷在大鼠体内的药动学胡楠蒋振伟钱敏燕张雯婷陈陆俊郑晓应汉杰蒋敬庭(.苏州大学附属第三医院药学部常州.苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心常州.南京工业大学生物与制药工程学院南京)摘 要 目的 建立血浆虫草素及代谢物 脱氧肌苷()的液相色谱串联质谱(/)测定方法研究其在大鼠体内的药动学 方法以 氯腺苷()为内标甲醇沉淀蛋白色谱柱为 (.)流动相为水(乙酸铵)甲醇溶液梯度洗脱 电喷雾离子源正离子多反应监测 研究大鼠灌胃虫草素()后血浆虫草素及 药动学 结果 虫草素和 分别在.和 范围内线性关系良好定量下限分别为.和 大鼠灌胃虫草素后血浆虫草素浓度较低主要转化为 虫草素和 的峰浓度()分别为(.)和(.)血药浓度时间曲线下面积()分别为(.)和(.)结论 该方法简单、灵敏、准确适用于虫草素与 血药浓度测定及药动学研究关键词 虫草素脱氧肌苷药动学液相色谱串联质谱法中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.医药导报 年 月第 卷第 期.)/()().().(.)().().().(.)(.)(.)(.).虫草素()又称 脱氧腺苷是蛹虫草的主要活性成分是从真菌分离出的第一个核苷类抗生素 作为一种腺苷衍生物虫草素具有降糖降脂、保护神经、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和调节免疫、抗肿瘤等多种药理作用 虫草素可通过嘌呤核苷代谢途径在腺苷脱氨酶催化作用下快速脱氨形成代谢产物 脱氧肌苷()虫草素及代谢物的化学结构式见图 虫草素的快速脱氨使其在体内半衰期短清除率高 因此虫草素无论是口服还是静脉注射给药在体内的暴露量都非常少有研究报道灌胃给药后大鼠全血样品中未检测到虫草素原型药物大鼠静脉给予虫草素后在体内半衰期仅.虫草素发挥疗效的物质基础目前尚未明确且由于样本采集以及分析方法局限性限制了对虫草素在体内代谢过程的客观评估和宏观认识 因此笔者在本研究建立一种同时测定大鼠血浆虫草素及 浓度的液相色谱串联质谱(/)方法并应用于药动学研究收稿日期 修回日期 基金项目国家自然科学基金资助项目()江苏省中医药科技发展计划()江苏省科技计划专项资金(重点研发计划社会发展)项目()常州市社会发展科技支撑资金项目()常州市科技基 础 设 施 建 设 计 划常 州 市 临 床 药 学 重 点 实 验 室()作者简介 胡楠()女江苏常州人副主任药师硕士生导师博士研究方向:药物代谢动力学和临床药学:电话:.通信作者 蒋敬庭()男江苏常州人教授博士生导师博士研究方向:肿瘤免疫学:.材料与方法.仪器 高效液相色谱()仪、三重四极杆串联质谱仪(上海爱博才思分析仪器贸易有限公司)涡旋混合器(美国英思科公司)低温高速离心机(艾本德中国有限公司)纯水仪(密理博中国有限公司)电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司感量:.)图 虫草素()、脱氧肌苷()和内标 氯腺苷()的结构式.()()().试剂 虫草素对照品(南京生命原健康科技有限公司含量:批号:)(中国食品药品检定研究院批号:)内标 氯腺苷(阿拉丁公司批号:含量:)甲醇(公司色谱纯)乙酸铵(公司分析纯).实验动物 雄性 大鼠常州卡文斯实验动物有限公司提供实验动物生产许可证号:(苏)实验动物合格证号:.方法.色谱条件 (.)()流动相:水(乙酸 铵)流动相:甲醇 梯度洗脱流动相 和 比例:.流 速:.柱温 .质谱条件 电喷雾离子源()正离子检测模式多反应监测()扫描 虫草素、和选用离子对、去簇电压和碰撞电压分别为虫草素:/.和 :/.和 内标:/.和.标准品储备液的配制 精密称取虫草素 分别加入适量甲醇溶解配制成虫草素、和 浓度分别为、的标准品储备液.血浆样品的处理取血浆 加入含有内标()的甲醇溶液 沉淀蛋白涡旋震荡 离心 (.)取上清液 加超纯水 涡旋 离心 (.)取上清液进样.方法学验证专属性实验取不同来源大鼠空白血浆 份、加入待测药物对照品的大鼠血浆样品、用药后血浆样品按照“.节”方法处理分析标准曲线和定量下限精密量取虫草素与储备液适量加甲醇溶液梯度稀释成分别含虫草素、标准系列工作溶液 取工作液 加空白血浆 配成相当于虫草素.、的标准曲线 按照“.节”方法处理 以待测物与内标物峰面积比为纵坐标()、待测物浓度()为横坐标()以加权(/)最小二乘法进行线性回归运算精密度与准确度 取标准品储备液加入空白血浆配制成分别含虫草素和 低、中、高浓度的质量控制()样本其中虫草素浓度分别为.、.和 浓度分别为.、和 按照“.节”方法处理每个浓度取 份在 周内测定 次 根据当天标准曲线计算 样品浓度得到批内和批间精密度、准确度提取回收率和基质效应 按“精密度与准确度”项下制备虫草素和 各 个浓度 样本按照“.节”方法处理、进样测得待测物峰面积比值 取空白血浆进行预处理分别取上清液加入相应低、中、高浓度标准溶液每个浓度 份测得待测物峰面积比()提取回收率()/取纯化水代替空白血浆进行上述操作制备基质效应考察样本测得待测物峰面积比()基质效应()/稳定性实验 按“精密度与准确度”项下制备虫草素和 各 个浓度 样本分别考察虫草素室温和 下放置、和 和 下放置、和 后稳定性 冻融 次及以上稳定性以及进样器 稳定性 考察 室温和 稳定性 和 下 稳定性 冻融 次稳定性和进样器 稳定性药动学研究取雄性 大鼠 只体质量约 灌胃给予虫草素 ()给药后分别于、和 经眼眶取血取血后即刻 (.)迅速离心 取上清液分装按“.节”处理样本剩余样本 保存样本处理时间控制在 内 采用 软件非房室模型进行拟合求算峰浓度()、达峰时间()、半衰期(/)、血药浓度时间曲线下面积()及平均驻留时间()等药动学参数 实验数据以均数标准差()表示 本研究经苏州大学附属第三医院伦理委员会批准伦理审查批号:()科第 号 结果.专属性实验结果虫草素、与内标 保留时间分别为.、.和.血浆内源性物质在待测物保留时间内无干扰结果见图.标准曲线与定量下限虫草素标准曲线为:.(.)在.范围内线性关系良好定量下限.(/)标准曲线为:.(.)在 范围内线性关系良好定量下限 (/)可满足血浆样本中虫草素与 含量测定.精密度与准确度实验结果 虫草素与 低、中、高浓度质控样本精密度和准确度良好日内与日间 均均符合生物样本分析要求结果见表.提取回收率与基质效应虫草素及 低、中、高浓度质控样本提取回收率良好虫草素及 提取回收率别为.和.两种物质 均不超过.虫草素及 基质效应分别为.和.医药导报 年 月第 卷第 期.空白血浆.空白血浆加标准品.大鼠给药后血浆样品图 大鼠血浆中虫草素、与 的/色谱图./表 虫草素与 准确度与精密度实验结果.化合物与浓度/()日内实测浓度/()准确度日间实测浓度/()准确度虫草素.结果见表.稳定性 本研究主要考察室温稳定性、冻融稳定性、稳定性、稳定性、稳定性及进样器稳定性表 虫草素与 提取回收率及基质效应.化合物与浓度/()提取回收率提取回收率基质效应基质效应虫草素.血浆样本中的虫草素在室温和 放置时稳定性较差随着时间延长降解增加(图)其中室温放置 和 放置 内降解率 虫草素在 和 保存 内较稳定(图)室温下不同浓度虫草素在血浆样本中的降解和代谢物 生成情况见图 随着时间延长血浆虫草素含量逐渐减少而代谢物 含量逐渐增加 后血浆几乎检测不到虫草素代谢物 生成量占原药.虫草素在室温 、自动进样器 、冻融一次条件下稳定(表)虫草素在冻融 次及以上稳定性差 稳定性较好在室温 、自动进样器 、冻融 次条件下稳定(表).药动学研究结果 大鼠灌胃虫草素 后血浆虫草素与 药动学参数见表 虫草素与 血药浓度时间曲线见图 讨论笔者在本研究建立了一种具有较高灵敏度和准确度、可同时检测血浆样本中虫草素及代谢物 的/方法 虫草素极性较大在 柱中保留较差在 柱中保留较好 笔者考察了不同流速(.、.和.)的影响发现随着流速增大 峰型变差出现裂峰.流速较合适此外有机相比例增加会导致 峰展宽并伴随基线升高但对虫草素无影响虫草素在血浆样本中稳定性较差室温放置超过 或 放置超过 可降解超过 在空白血浆样本中加入虫草素室温下放置 后血浆中虫草素几乎全部降解 为进一步研究虫草素降解过程笔者对虫草素血浆样本室温放置不同时间后的浓度进行了动态分析发现随着血浆中虫草素含量降低代谢物 含量逐渐增加 生成量占原药.提示血浆中的酶无论是在体内还是体外均可代谢虫草素且 是生成含量最多的代谢物 为保证药动学研究准确性对虫草素药动学操作流程进行优化缩短样本在室温放置时间加快样本处理过程即取血后立即在低温下处理样本并将整个过程控制在 内减少虫草素在血浆样本中的降解临床应用虫草素一般采取口服给药动物研究常采用灌胃给药途径剂量 有关虫.室温.图 在不同温度和不同时间下的虫草素在血浆中的稳定性().()医药导报 年 月第 卷第 期.虫草素.虫草素.虫草素 图 室温下虫草素降解情况及 生成情况().()表 虫草素稳定性实验结果 .浓度/()室温 自动进样器 冻融 次.表 稳定性实验结果 .浓度/()室温 自动进样器 冻融 次 .表 大鼠灌胃虫草素后虫草素与 的药动学参数.化合物/()/()/()/虫草素.图 大鼠灌胃虫草素 后虫草素()与 ()血药浓度时间曲线.()()()草素药动学研究的报道笔者较少见到 吴灵玉等通过 法检测大鼠灌胃 虫草素后血药浓度由于 检测灵敏度限制给药后 均未检测到虫草素原型药物 等研究了大鼠灌胃虫草素 药动学同样未检测到虫草素原型 本研究中由于采用了高灵敏度/方法在多个时间点检测到血浆中虫草素浓度但虫草素在大鼠体内暴露量非常低血药浓度仅约 在吴灵玉等的研究中曾检测到一个分子量为 的未知代谢物(推测为)该物质在 时含量最高随后降低而在本研究中 为(.)与之一致 等也在血浆中检测到了代谢物 其 为()/为(.)为()与本研究中 的药动学参数为()/为(.)为()较为接近 也有学者研究了大鼠静脉注射给药虫草素()药动学其结果显示全血中虫草素峰浓度较高(.)但半衰期短(.)虫草素在体内可被代谢生成多种代谢物但有关其代谢物的鉴定尚未明确 血浆中检测到含量最多的代谢物是 但对其的活性及药理作用目前尚无统一认识 目前普遍认为 是虫草素的一种无活性代谢物 也有研究认为 具有一定抗寄生虫、抗肿瘤作用 近期有学者提出虫草素在体内存在补偿代谢途径即 可转化为有活性的三磷酸虫草素从而发挥药理作用 对虫草素口服吸收和生物转化过程以及暴露效应关系的研究对于阐明虫草素发挥各种药理作用的物质基础具有重要意义 虫草素及其代谢物的体内代谢过程及其与药理活性的关系仍有待进一步深入研究参考文献 .(.).():.():.:.():.():.吴灵玉王雪艳陈志宝等.测定大鼠全血中虫草素药代动力学方法的建立.黑龙江八一农垦大学学报():.():./.()():.:.():.():.朱丽君孙珊珊王志萍等.虫草素体外大鼠肝微粒体代谢初步研究.药物分析杂志():.():.():.:.():.():.医药导报 年 月第 卷第 期