基于流式量子点微球技术的甲乙型流感病毒抗原检测方法的建立和初步应用分析.pdf
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1、126现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024基于流式量子点微球技术的甲乙型流感病毒抗原 检测方法的建立和初步应用分析夏成静1,李宝花1,郭燕妳1,周小合1,张润玲1,牛英波21.深圳光明区人民医院(西)检验科,广东深圳 518106;2.南京诺唯赞医疗科技有限公司,南京 210033摘要:目的建立基于流式量子点微球技术的甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)抗原联检方法,为常见呼吸道病毒抗原多重检测打下基础。方法分别使用自制的不同量子点编码微球和小鼠抗 FluA/FluB 核蛋白(NP)单克隆抗
2、体进行偶联,在流式细胞仪上对已知浓度的甲乙型流感病毒抗原分别和同时进行检测,对检测条件进行优化,建立甲乙型流感病毒抗原联检方法,利用此方法对临床样本进行检测,与实时荧光定量 PCR 法(quantitative real-time PCR,qPCR)进行比对,验证此方法的临床性能。结果建立了甲乙型流感病毒抗原联检方法,该方法的甲乙型流感病毒抗原的检出限分别为 26.1 pg/ml 和 10.7 pg/ml,测量范围均为 15.3 250 000 pg/ml。对临床样本检测,与 qPCR 比对一致性良好,阳性符合率为 57.4%,阴性符合率为 100%,总符合率 71.6%,并优于临床常用胶体金
3、试剂(阳性符合率为 56.49%,阴性符合率为 99.75%)。结论此流式量子点微球多重检测方法可以用于甲乙型流感病毒抗原的联检,其灵敏度较高、特异度好、检测范围广,可以为呼吸道常见病毒多重检测打下良好基础,在临床上具有应用前景。关键词:甲型流感病毒;乙型流感病毒;量子点编码微球;液相蛋白芯片中图分类号:R373.13;R446.62文献标识码:A文章编号:1671-7414(2024)01-126-05doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2024.01.023Establishment and Preliminary Application Analysis of A
4、Multiplex Detection Method for Influenza A and B Virus Antigen Based on Quantum Dot-encoded Microsphere Flow Cytometry TechnologyXIA Chengjing1,LI Baohua1,GUO Yanni1,ZHOU Xiaohe1,ZHANG Runling1,NIU Yingbo21.Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Guangming District Peoples Hospital(West Wing),Gua
5、ngdong Shenzhen 518106,China;2.Nanjing Vazyme Biotech Co.Ltd,Nanjing 210033,ChinaAbstract:ObjectiveTo establish a multiplex assay method for the simultaneous detection of FluA and FluB virus(IBV)antigen based on the flow cytometry(FCM)quantum dot-encoded bead technologies,laying the foundation for t
6、he assay of multiple respiratory virus biomarkers.MethodsCoupling was performed for FluA and FluB nucleoprotein(NP)monoclonal antibodies using self-made quantum dot-encoded beads,separately.FCM was used to detect known concentrations of FluA and FluB antigens separately and simultaneously,optimize t
7、he detection conditions,and establish a joint detection method for FluA and FluB antigens.Compared with the quantitative real-time PCR(qPCR)method,clinical samples were used to evaluate the clinical performance of this joint detection method.ResultsThe joint detection method for FluA and FluB antige
8、ns was established,with detection limits of 26.1 pg/ml and 10.7 pg/ml,respectively,and measurement ranges of 15.3 250 000 pg/ml.The joint detection method for clinical sample evaluation was well correlated with the qPCR,with a positive coincidence rate of 57.4%,a negative coincidence rate of 100%,an
9、d a total coincidence rate of 71.6%.In addition,the joint detection method was superior to colloidal gold immunochromatographic strip assay commonly used in clinical practice(positive coincidence rate of 56.49%,negative coincidence rate of 99.75%).ConclusionThe FCM quantum dot-encoded bead multiplex
10、 assay can be used for the joint detection of FluA and FluB antigens,which have a high sensitivity,good specificity and wide detection range.It may lay a good foundation for the multiplex detection of common respiratory viruses,and has clinical application prospects.Keywords:FluA;FluB;quantum dot-en
11、coded beads;liquid protein chip呼吸道病毒引起的感染和防治是全世界普遍面临的公共卫生挑战。近几年发生的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)大流行,基金项目:深圳光明区软科学研究项目(项目批号 2021R01097)。作者简介:夏成静(1976),男,硕士学位,主管技师,临床检验诊断学,临检专业,E-mail:。让全世界的公众和公共卫生机构、政策制定者更加重视呼吸道病毒引起的传染病1-2。由于不同呼吸道病毒及同一病毒不同亚型的治疗方式和防控措施127现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mo
12、d Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024可能不同,快速精确地鉴定这些病毒及其亚型不仅可以为疾病诊断、治疗提供充足的依据,也可为流行病学调查、疫情防控提供坚实的基础3-4。因此,寻找一种快速、灵敏、多重检测呼吸道病毒的方法是非常必要的。而液相蛋白芯片由于可以快速、高通量、平行化的检测多个病毒蛋白(抗原或抗体),在多重检测领域有着独特的优势5-7。液相蛋白芯片的核心原理是利用不同标记微球上联接的特异性分子去识别对应的检测物,因此如何制备信息种类丰富的编码微球成为此技术能否实现高通量、高灵敏、多重性检测的关键所在。目前,市场上的编码微球主要由 Luminex,Bangs Labo
13、ratories 等欧美公司垄断生产,不仅售价高,而且需要昂贵的多通道检测仪器进行检测。而与传统染料相比,具有吸收光谱范围宽、激发荧光光谱窄、发光效率高、发光谱随粒径大小可调、光稳定性好等优点的量子点(quantum dot,QD)逐渐成为了液相芯片中研究最热的荧光编码粒子8-12。本研究拟开发一种针对甲型流感病毒(FluA)及乙型流感病毒(FluB)抗原的多重流式检测方法,利用量子点编码微球作为反应载体,建立基于流式量子点微球技术的甲乙型流感病毒抗原联检方法,为常见呼吸道病毒多重检测打下基础。1材料与方法1.1研究对象随机收集中国科学院大学深圳医院(光明)西院区 2022 年 5 8 月门诊
14、就诊的疑似甲乙型流感病毒感染咽拭子,随机选取 81 例,其中男性 43 例,女性 38 例,年龄 1 63 岁。患者样本均使用甲型/乙型抗原检测试剂盒(胶体金法)进行了流感病毒感染的临床诊断,并将剩余咽拭子样本冻存于-80。纳入标准:具有呼吸道病毒感染临床症状表现的患者。排除标准:采样前一个月内服用过抗流感药物者。本研究已通过中国科学院大学深圳医院(光明)伦理委员会评审通过。1.2仪器与试剂流式细胞仪(Beckman 公司);实时荧光定量 PCR 仪(Life Technologies 公司);酶标仪(BioTek 公司)。FluA/FluB 核蛋白(nucle-oprotein,NP)抗原及
15、其配对抗体对(南京诺唯赞医疗科技有限公司)。荧光编码微球(Bangslabs 公司);聚苯乙烯微球(苏州纳微科技股份有限公司);N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinim-ide,sulfo-NHS),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-eth-ylcarbodiimide hydrochloride,EDC,2-吗 啉 乙 磺酸(MES)均购自 Sigma 公司;样本稀释液及清洗液由磷酸缓冲液、Tween-20 和牛血清清蛋白配制而成,所用试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;生物素标记试剂盒(
16、Thermo fisher 公司);CdSe/ZnS 量子点纳米晶体(武汉珈源量子点技术开发有限责任公司);FITC donkey anti-mouse IgG(Jackson 公司);链霉亲和素-藻红蛋白染料(SA-PE,BD公司);96孔过滤板(Millipore公司);qPCR 试剂及配套耗材(广州达安基因股份有限公司);甲/乙型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金法,广州万孚生物技术股份有限公司)。1.3方法1.3.1量子点编码微球检测体系构建1.3.1.1量子点编码微球制备:首先对聚苯乙烯微球进行溶胀,然后在溶胀体系中加入不同浓度的CdSe/ZnS 量子点对其进行荧光染色,染色完成后将微球
17、从有机相溶胀体系中转移到水相保存体系中。通过调整量子点和聚苯乙烯微球的浓度比例,获得不同亮度的多峰量子点编码微球。由于聚苯乙烯微球表面具有羧基修饰,因而可以用于后续的抗体偶联。1.3.1.2抗体与微球的偶联:采用 EDC/Sulfo-NHS 方法活化羧基微球后再与 FluA/FluB-NP 配对单抗进行偶联。具体步骤为:将 106个微球使用 50 mmol/L MES 缓冲液洗涤数次后,加入 0.2mg sulfo-NHS,0.2mg EDC,迅速涡旋混匀,室温翻转孵育20min。对活化后的微球进行洗涤后,加入包被抗体,迅速涡旋混匀,室温翻转孵育 2h。对偶联后的微球进行洗涤、浓度测定、产率计
18、算、偶联确认。为了后续最优抗体对组合的筛选测试,将不同克隆号的 FluA/FluB-NP 单抗(Clone:FluA6,FluA8,FluB15,FluB66,FluB79)均进行偶联。1.3.1.3生物素标记抗体的制备:按照 Thermo fisher生物素标记试剂盒说明书进行抗体标记,使用酶标仪对生物素标记抗体进行浓度测定并通过 HABA 分析法(harmonic analysis based on approximation,基于谐波分析的近似方法)测定结合在抗体上的生物素的浓度,计算生物素与抗体蛋白摩尔比(Biotin/Protein,B/P)。1.3.2FluA 和 FluB 抗原单
19、检的性能测试:基于量子点编码微球的 FluA 和 FluB 抗原多重检测方法的开发,需要先进行 FluA 和 FluB 单检方法的建立和验证,然后将该单检方法进行联检测试。单检测试主要包括以下步骤:校准品的制备:将 FluA/FluB 的 NP 抗原母液以等比稀释的方式稀释为一系 列 浓 度:1 000 000,250 000,62 500,15 625,3 906.3,976.6,244.1,61.0 和 15.3pg/ml;免疫反应:在 96 孔过滤板中依次加入稀释液、校准品/样本、生物素标记的检测抗体、包被抗体偶联的捕获微球,避光震荡孵育 2.5h 后,加入链霉亲和素-128现代检验医学
20、杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024藻红蛋白(SA-PE),避光震荡孵育 0.5h 后,使用真空抽滤装置进行抽滤,使用清洗液进行清洗后再次抽滤,使用清洗液将微球重悬收集等待上机测试;上机与数据处理:使用流式细胞仪对各收集管进行上机采集数据,将获得的中值荧光强度(median fluorescence intensity,MFI)数据导入到 Graphpad Prism 9.0 软件中进行分析;以校准品的一系列MFI 值与校准品的浓度绘制校准曲线,利用校准曲线方程计算样本的浓度。单检方法的初步性能评估主要包括测量范围和
21、交叉反应。通过观察不同浓度校准品在校准曲线上的分布,确定该方法针对 FluA和 FluB 抗原浓度的测量范围。1.3.3FluA 和 FluB 抗原联检的性能测试:甲乙型流感病毒抗原联检测试,是在单检测试的基础上,在同一个反应体系中,直接加入 FluA 和 FluB 抗原的两种捕获微球以及 FluA 和 FluB 抗原的两种生物素标记的检测抗体,以同时促成 FluA 和 FluB 抗原检测夹心的分别形成,并最终通过编码微球作为信号传递媒介,在流式细胞仪上输出 FluA 和 FluB 微球的检测荧光信号,进而获得校准曲线和样本浓度的结果,见图 1。参照相关文献的描述12-13,对量子点微球的联检
22、方法进行性能评估,包括检出限、测量范围、交叉反应。图 1基于量子点编码微球的甲乙型流感病毒抗原多重检测的原理示意图1.3.4基于流式量子点微球技术的 FluA 和 FluB 联检平台对临床样本的验证和方法学比对:将-80保存的临床咽拭子样本放置在室温下解冻 30min后,置入 500l 提取液中沿管壁旋转约 10 次,使标本尽可能溶解入提取液中。将提取好的样本液一分为二,一份用于本方法进行抗原检测,另一份使用 qPCR 进行核酸检测(具体操作严格按照仪器厂家和试剂说明书进行)。本方法以 FluA 和 FluB抗原检测的检出限作为阴阳性判断的临界值,与qPCR 检测的阴阳性结果进行对比,分析其临
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