FTO介导m6A修饰的PRKD2调节SIRT1_HIF-1α通路抑制糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究.pdf
《FTO介导m6A修饰的PRKD2调节SIRT1_HIF-1α通路抑制糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《FTO介导m6A修饰的PRKD2调节SIRT1_HIF-1α通路抑制糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、5现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024FTO 介导 m6A 修饰的 PRKD2 调节 SIRT1/HIF-1 通路 抑制糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究李亚宁,李成乾(青岛大学附属医院内分泌科,山东青岛 264200)摘要:目的探究脂肪含量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白激酶 D2(serine-threonine kinase protein kinase D2,PRKD2)在糖尿病肾病(diabetic ki
2、dney disease,DKD)进展中的调控作用和调节机制。方法采用 35 mmol/L 葡萄糖对足细胞(MPC5 细胞)进行高糖刺激 24h 构建 DKD 体外模型。采用 FTO 过表达载体(pcDNA-FTO)和 PRKD2 过表达载体(pcDNA-PRKD2),或空载体(vector)转染高糖诱导的 MPC5 细胞。通过 RT-qPCR 检测 FTO 和 PRKD2 过表达效率;MeRIP 检测 PRKD2 mRNA 的 N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰水平;ELISA 检测 Caspase-3 活性、IL-6,TNF-和单核细胞趋化蛋白-1(mono
3、cyte chemotactic protein-1,MCP-1)分泌量;流式细胞术分析细胞凋亡率;Western blot 评估 FTO 和 PRKD2 蛋白水平,以及 SIRT1/HIF-1 通路关键蛋白表达水平;Pearson 分析 FTO 和 PRKD2 水平的相关性。结果与无高糖诱导对照组比较,高糖诱导的足细胞中 FTO 蛋白(0.51 0.04 vs 1.00 0.03)和 PRKD2 蛋白(0.45 0.03 vs 1.01 0.04)水平显著下调,差异具有统计学意义(t=13.17,16.76,均 P0.001)。高糖诱导的足细胞中 FTO 蛋白水平和 PRKD2 蛋白水平呈正
4、相关(r2=0.705 1,P0.001)。与 vector 组相比,pcDNA-FTO 组 PRKD2 mRNA 的 m6A 水平(0.56 0.09 vs 1.01 0.13)降低,PRKD2 mRNA 水平(3.160.14 vs 1.030.02)显著升高,差异具有统计学意义(t=51.37,11.82,均 P0.001)。与 control 组(IL-6:512.76 61.85 pg/ml,TNF-:28.17 2.83 pg/ml,MCP-1:157.31 17.69 pg/ml)和 vector 组(IL-6:498.41 87.51 pg/ml,TNF-:26.35 5.47
5、 pg/ml,MCP-1:165.52 16.87 pg/ml)比较,pcDNA-PRKD2 组 IL-6(301.86 21.85 pg/ml),TNF-(11.06 4.12 pg/ml),MCP-1 分 泌 量(81.45 9.03pg/ml)显著减少,差异具有统计学意义(F=7.51,10.47,61.97,均 P0.01)。与 control 组(Caspase-3:689.65 79.5 U/L,细胞凋亡率:22.31%2.69%)和 vector 组(Caspase-3:715.91 113.58 U/L,细胞凋亡率:21.07%3.28%)比较,pcDNA-PRKD2 组 Ca
6、spase-3 活性(437.64 104.76 U/L)和细胞凋亡率(8.41%3.15%)下降,差异具有统计学意义(F=2.35,79.13,均P0.01)。与control组(SIRT1:1.01 0.05,HIF-1:1.03 0.07)和vector组(SIRT1:0.97 0.05,HIF-1:1.02 0.03)相比,pcDNA-PRKD2组SIRT1蛋白(3.51 0.15)水平升高,HIF-1蛋白(0.37 0.07)水平降低,差异具有统计学意义(F=31.54,8.31,均 P0.01)。结论FTO 介导 m6A 修饰的 PRKD2 通过 SIRT1/HIF-1 通路抑制高
7、糖诱导的足细胞炎症反应和细胞凋亡。关键词:糖尿病肾病;足细胞;N6 甲基腺苷修饰;脂肪和肥胖相关蛋白;丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白激酶 D2中图分类号:R587.2;R392.11文献标识码:A文章编号:1671-7414(2024)01-005-06doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2024.01.002Mechanism of FTO-mediated and m6A-modified PRKD2 Inhibiting Podocyte Injury in Diabetic Kidney Disease through the SIRT1/HIF-1 PathwayLI
8、Yaning,LI Chengqian(Department of Endocrinology,Affiliated Hospital of Qingdao University,Shandong Qingdao 264200,China)Abstract:ObjectiveTo explore the regulatory role of fat mass and obesity-associated protein(FTO)and serine-threonine kinase protein kinase D2(PRKD2)in progression of diabetic kidne
9、y disease(DKD)and its regulatory mechanisms.MethodsDKD model in vitro was constructed by podocytes(MPC5 cells)treated with high glucose(HG,35 mmol/L glucose)for 24 h.HG-induced MPC5 cells were transfected with FTO overexpression vector(pcDNA-FTO)and PRKD2 overexpression vector(pcDNA-PRKD2),or empty
10、vector.The overexpression efficiency of FTO and PRKD2 were detected with RT-qPCR.MeRIP was used to detect the N6-methyladenosine(m6A)modification level of PRKD2 mRNA.The activity of Caspase-3 and the secretion of IL-6,TNF-and monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)were detected by ELISA.Cell apoptosis
11、 rate was analyzed by flow cytometry.The protein levels of FTO and PRKD2,as well as the key proteins in SIRT1/HIF-1 pathway,were evaluated by Western blot.Pearson analysis was used to analyze the correlation between FTO levels and PRKD2 levels.ResultsCompared 作者简介:李亚宁(1985-),女,本科,硕士研究生在读,副主任医师,研究方向:
12、糖尿病发病机制、糖尿病诊治,E-mail:he_。通讯作者:李成乾(1974-),男,博士,副主任医师,E-mail:。6现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024with the control group without HG-induction,the protein expression of FTO(0.51 0.04 vs 1.00 0.03)and PRKD2(0.45 0.03 vs 1.01 0.04)was significantly down-regulated in HG-induced
13、 podocytes,and the differences were statistically significant(t=13.17,16.76,all P0.001).FTO protein levels were positively correlated with PRKD2 protein levels in HG-induced podocytes(r2=0.705 1,P0.001).Compared with the vector group,the m6A levels of PRKD2 mRNA(0.56 0.09 vs 1.01 0.13)in the pcDNA-F
14、TO group were decreased,and the mRNA levels of PRKD2(3.16 0.14 vs 1.03 0.02)were increased,with significant differences(t=51.37,11.82,all P0.001).Compared with the control group(IL-6:512.76 61.85 pg/ml,TNF-:28.17 2.83 pg/ml,MCP-1:157.31 17.69 pg/ml)and the vector group(IL-6:498.41 87.51 pg/ml,TNF-:2
15、6.35 5.47 pg/ml,MCP-1:165.52 16.87 pg/ml),the secretion of IL-6(301.86 21.85 pg/ml),TNF-(11.06 4.12 pg/ml)and MCP-1(81.45 9.03 pg/ml)were significantly decreased in the pcDNA-PRKD2 group,and the differences were statistically significant(F=7.51,10.47,61.97,all P0.01).Compared with the control group(
16、caspase-3 activity:689.65 79.5 U/L,cell apoptosis:22.31%2.69%)and the vector group(Caspase-3 activity:715.91 113.58 U/L,cell apoptosis:21.07%3.28%),Caspase-3 activity(437.64 104.76 U/L)and the rate of apoptosis(8.41%3.15%)were significantly decreased in the pcDNA-PRKD2 group,and the differences were
17、 statistically significant(F=2.35,79.13,all P0.01).Compared with the control group(SIRT1:1.01 0.05,HIF-1:1.03 0.07)and the vector group(SIRT1:0.97 0.05,HIF-1:1.02 0.03),SIRT1 protein levels(3.51 0.15)were increased and HIF-1 protein levels(0.37 0.07)were decreased in the pcDNA-PRKD2 group,and the di
18、fferences were statistically significant(F=31.54,8.31,all P0.01).ConclusionFTO-mediated and m6A-modified PRKD2 suppresses inflammation and apoptosis in HG-induced podocytes through the SIRT1/HIF-1 pathway.Keywords:diabetic kidney disease;podocytes;N6-methyladenosine modification;fat mass and obesity
19、-associated protein;serine-threonine kinase protein kinase D2糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病常见的微血管并发症,也是世界终末期肾脏病的第二位原因1。目前常见治疗方法如控制血糖或血压,只能实现部分肾保护2-3。因此开发新的且有效的治疗方法成为了DKD研究的首要任务。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞,在维持肾小球滤过屏障的完整性方面起着重要作用4。研究证实,足细胞功能障碍或损伤是 DKD 发生发展的核心事件5-6。确定介导足细胞损伤的关键因素将为理解 DKD 发病机制提供重要见解。有报道显示,
20、丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白激酶 D2(serine-threonine kinase protein kinase D2,PRKD2)缺乏会促进胰岛素抵抗和代谢紊乱,引发高胰岛素血症7。高胰岛素血症等异常的代谢综合征会导致 DKD 发生8-9。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化是真核生物 mRNA 中普遍存在的修饰,m6A 修饰可以维持 mRNA 的稳定性、转运、剪接、定位、翻译和蛋白 RNA 相互作用10-11。据报道显示,m6A 修饰可以调节炎症和凋亡,是介导 DKD 病理损伤的重要机制6,12。然而,PRKD2 和 m6A 在DKD 发病中的生物学作用尚不清
21、楚。本研究通过高糖诱导小鼠足细胞构建 DKD 体外模型,分析了PRKD2 和 m6A 去甲基化酶脂肪含量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)在高糖诱导的小鼠足细胞中的表达及其调控关系,探究FTO介导的PRKD2对DKD进展的调控机制。1材料与方法1.1研究对象小鼠足细胞(MPC5)购自中国医学科学院基础医学研究所,在含 10 g/dl 胎牛血清和 20 U/ml 小鼠重组干扰素-(interferon-,IFN-)的 RPMI 1640 培养液中于 33下培养。1.2仪器与试剂Magna RIP RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒
22、(17-701,Millipore Sigma);Lipofectamine RNAiMAX试剂盒(13,778-030,Invitrogen Life Technol-ogies);Anti-actin 抗 体(ab8226,Abcam);Anti-m6A抗体(ab284130,Abcam);Anti-FTO(ab280081,Abcam);Anti-SIRT1(ab110304,Abcam);An-ti-IgG(ab302644,Abcam);Anti-HIF-1(ab179483,Abcam);半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3(Cys-teinyl aspartate-specific
23、proteinase-3,Caspase-3,G015-1-3),白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6,H007-1-2),肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-,H052-1-2)及单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1,H115)检 测 ELISA试剂盒(南京建成);Trizol 试剂(Life Technolo-gies,Carlsbad,CA);ExoQuick exosome 提取试剂盒(System Biosciences,美 国);Prime Script RT 反转录试剂盒(
24、Takara,中国大连);miScript SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒(QIAGEN,德国);RIPA 裂解缓冲液和 BCA 蛋白测定试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology,上海);ECL 化学发光试剂盒(Thermo Scientific,美国);MK3 型酶标仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司);Multizoom AZ100 型光学生物显微镜 尼康仪器(上海)有限公司;Centrifuge5804R 型高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司);Tanno 5200 型化学发光凝胶成像仪(上海天
25、7现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024能科技有限公司);Spectra-Maxi3x型多功能酶标仪(美国 MD 公司)。1.3方法1.3.1细胞培养:未分化的 MPC5 细胞在含 10 g/dl胎牛血清和 20 U/ml 小鼠重组 IFN-的 RPMI 1640培养液中 33 培养。诱导分化时,将足细胞在不含 IFN-的非允许条件下 37 维持 7 天进行实验。建立体外足细胞损伤模型时,将分化的足细胞在含 1 g/dl 胎牛血清的培养液中饥饿 12h,后接受35 mmol/L 葡萄糖进行高糖刺激 24 h
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- FTO 介导 m6A 修饰 PRKD2 调节 SIRT1_HIF 通路 抑制 糖尿病肾病 细胞 损伤 机制 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
链接地址:https://www.zixin.com.cn/doc/2896332.html