怀地黄不同炮制品中5种成分差异的研究.pdf

第 7 卷第 3 期2023 年 9 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.3Sep.2023收稿日期:2022-05-31基金项目:河南省教育厅重点项目(19B360002);河南牧业经济学院院级重点培育学科-中兽药生药学项目(41000003)作者简介:王新民(1970),男,河南虞城人,博士,副教授。怀地黄不同炮制品中 5 种成分差异的研究王新民1,黄小婉1,2,杨影影1,魏志华1(1.河南牧业经济学院,河南 郑州 450046;2.郑州大学 河南 郑州 450001)摘要:采用甲醇超声和加热回流两种方式制得生地黄、熟地黄、生地炭和熟地炭等 4 种怀地黄炮制品,利用高效液相色谱法测定其梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷和 5-羟甲基糠醛等有效成分的含量。生地黄经炮制后,其炮制品中的梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D 和毛蕊花糖苷含量减少,而 5-羟甲基糠醛含量增加。甲醇超声制得的地黄炮制品中的梓醇、地黄苷 D 和毛蕊花糖苷含量高于加热回流法制得的地黄炮制品,而 5-羟甲基糠醛含量低于加热回流法制得的地黄炮制品。超声处理生地黄中梓醇含量最高,为 1.18%(超声提取),加热回流处理熟地炭中梓醇含量最低,为 0.31%。甲醇超声制得的生地黄炮制品中地黄苷 A、地黄苷 D 和毛蕊花糖苷含量分别为 0.17%、0.65%和 0.03%,而加热回流制得的熟地炭中 5-羟甲基糠醛含量为 0.23%。建议采用超声提取法测定地黄药材有效成分含量。关键词:怀地黄;炮制品;提取方法;有效成分中图分类号:S859.4 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)03-0008-05Study on the difference of five components in different processed products of Rehmanniae radixWANG Xinmin1,HUANG Xiaowan1,2,YANG Yingying1,WEI Zhihua1(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou Henan 450046;2.Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450001)Abstract:Four processed products of Radix rehmanniae i.e.Raw Radix rehmanniae,Prepared Radix rehmanniae,biogenic charcoal and mature charcoal were prepared by methanol ultrasound and heating reflux.The contents of catalpol,Radix rehmanniae glycoside A,Radix rehmanniae glycoside D,mullein glycoside and 5-hydroxymethyl furfural were determined by HPLC.After processed,the contents of catalpol,Rehmannia glycoside A and D,and mullein glycoside in processed Rehmannia glutinosa decreased,while the content of 5-hydroxymethyl furfural increased.The contents of catalpol,Rehmannia glycoside D and mullein glycoside in processed Rehmannia glutinosa prepared by methanol ultrasonic method were higher than those prepared by heating reflux method,while the content of 5-hydroxymethyl furfural was lower than that of processed Rehmannia glutinosa prepared by heating reflux method.The highest catalpol content in raw Rehmannia glutinosa was 1.18%(ultrasonic extraction),and the lowest catalpol content in mature rehmannia charcoal was 0.31%(heating reflux extraction).The contents of Rehmannia glycoside A,D and mullein glycoside in raw Rehmannia processed by methanol ultrasound were 0.17%,0.65%and 0.03%respectively,while the content of 5-hydroxymethyl furfural in cooked Rehmannia charcoal prepared by heating reflux was 0.23%.It is suggested to use ultrasonic extraction method to determine the active ingredients content of Rehmannia glutinosa.Key words:Rehmanniae radix;processed products;extraction method;active ingredients8王新民,等:怀地黄不同炮制品中 5 种成分差异的研究 地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科植物,其根茎入药,临床分为鲜地黄、生地黄和熟地黄,具有抗菌、抗病毒、降血糖、改善骨代谢和增强免疫力等功效,因主产于河南焦作(古怀庆府)一带,故名怀地黄,是河南省著名的“四大怀药”之一1,2。地黄中药材成分复杂,炮制方法多,炮制前后化学成分变化大,明确不同炮制品的有效成分及差异对于临床用药至关重要3。本试验研究甲醇超声法和加热回流提取法对生地黄、熟地黄、生地炭和熟地炭等 4 种怀地黄炮制品的 5 种有效成分含量的影响,探究怀地黄炮制品最佳提取方式,以期为怀地黄加工炮制提供依据。1 仪器与材料4 种怀地黄炮制品及炮制方法见表 1。表 1 地黄炮制品制备方法炮制品炮制方法生地黄取生地黄药材,切片,粉碎,过 40 目筛,装袋备用熟地黄4取熟地黄药材,切片,粉碎,过 40 目筛,装袋备用生地炭5取生地黄片,武火炒至焦黑色,发泡、鼓起时,取出放凉。粉碎,过 40 目筛,装袋备用熟地炭6取熟地黄片,武火炒至焦黑色,发泡、鼓起时,喷洒少量清水灭火星,取出放凉。粉碎,过 40 目筛,装袋备用梓醇对照品(L20N8Y48597,上海源叶生物科技有限公司)。地黄苷 A 对照品(L24J9Y58664,北京中科质检生物技术有限公司)。地黄苷 D 对照品(L27J9Y66643,北京中科质检生物技术有限公司)。毛蕊花糖苷对照品(Y21A9H59554,上海源叶生物科技 有 限 公 司)。5-羟 甲 基 糠 醛 对 照 品(H12M9Z61023,上海源叶生物科技有限公司)。主要仪器:莱伯泰科 LC-600 型高效液相色谱、高速粉碎机、多功率超声仪、烘箱及电子天平等。试剂:甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、65%乙醇(分析纯)、冰乙酸(分析纯)、磷酸(分析纯)和超纯水等。2 样品的制备2.1 供试品溶液的制备称取生地黄、熟地黄、生地炭和熟地炭样品约0.5 g,转移至 50 mL 容量瓶中,加入甲醇,定容至刻度。超声提取 30 min,冷却至室温,补足减失的质量,摇匀,滤过。取续滤液 25 mL,蒸干,残渣用 15%甲醇溶解后定容至 5 mL4。称取样品生地黄、熟地黄、生地炭和熟地炭样品约 0.5 g,转移至 250 mL 圆底烧瓶中,加入甲醇50 mL,称取质量后放至水浴锅内,78 加热回流提取1.5 h,冷却至室温,补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液 25 mL,蒸干,残渣用 15%甲醇溶解,定容至 5 mL5。2.2 对照品溶液的制备称取干燥至恒重的梓醇对照品 0.0058 g、地黄苷 A 对照品 0.0067 g、地黄苷 D 对照品 0.0048 g、毛蕊花糖苷对照品 0.0049 g 和 5-羟甲基糠醛对照品 0.0026 g,于 5 mL 棕色容量瓶中。加甲醇定容至5 mL。制成每 1 mL 对照品溶液含梓醇 1.160 mg、地黄苷 A 1.340 mg、地黄苷 D 0.960 mg、毛蕊花糖苷 0.098 mg 和 5-羟甲基糠醛 0.52 mg 的对照品溶液。用 0.45 m 微孔滤膜滤过。3 有效成分含量测定3.1 色谱条件采用高效液相色谱法测定怀地黄炮制品中梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛等 5 种成分含量,色谱条件如表 2 所示。表 2 怀地黄炮制品中 5 种成分测定时高效液相色谱条件测定成分色谱柱柱温/流速/(mL/min)流动相检测波长/nm梓醇LabTech-C18(1504.6 mm,5 m)30 1 乙腈-0.1%磷酸水(1 99)210地黄苷 ALabTech-C18(1504.6 mm,5 m)30 1乙腈-0.1%磷酸水(3 97)203地黄苷 DLabTech-C18(1504.6 mm,5 m)251乙腈-0.1%磷酸水(4 96)203 毛蕊花糖苷LabTech-C18(1504.6 mm,5 m)251乙腈-0.1%磷酸水(16 84)334 5-羟甲基糠醛LabTech-C18(1504.6 mm,5 m)251乙腈-0.1%磷酸水(11 89)284 9王新民,等:怀地黄不同炮制品中 5 种成分差异的研究3.2 方法学考查3.2.1 稳定性试验生地黄样品溶液制备后的 0、6、12、24 和 48 h,按照表 2 色谱条件分别测定其梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛等 5 种成分的含量。根据色谱参数,计算怀地黄炮制品的梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛等 5种成分峰面积的 RSD,分别为 0.72%、0.88%、0.74%、0.59%和0.64%,表明48 h 内供试品溶液稳定性良好。3.2.2 精密度试验按照表 2 色谱条件,测定梓醇对照品溶液的梓醇含量,连续进样 6 次,根据色谱峰参数,计算其峰面积的 RSD 为 0.51%。同样方法得到对照品地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷和 5-羟甲基糠醛峰面积的 RSD,分别为 0.62%、0.78%、0.72%和 0.93%,表明液相色谱法仪器精密度良好。3.2.3 重复性试验按照表 2 色谱条件进样,测定制备好的生地黄炮制品溶液的有效成分 6 次。根据色谱参数计算梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛等 5 种有效成分峰面积的 RSD,分别为 0.74%、0.97%、0.88%、0.79%和 0.95%,表明液相色谱法重复性良好。3.2.4 线性关系考察按照梓醇对照品溶液浓度的 0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 倍依次上机,得到峰面积 Y 与进样量 X 的关系方程式 Y=10483.624X-159.417,R2=0.9995,表明梓醇量为 0.1000-1.2000 mg 时,峰面积 Y 与进样量 X 之间存在良好的线性关系。同样方法得到对照品地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷和5-羟甲基糠醛峰面积 Y 与进样量 X 的关系方程式,分别为 Y=10554.773X-267.352(R2=0.9992)、Y=11532.618X-148.393(R2=0.9995)、Y=10698.335X-162.338(R2=0.9999)和 Y=10556.548X-149.392(R2=0.9998),峰面积和进样量之间均存在良好线性关系。3.3 有效成分含量测定供试品溶液和对照品溶液用 0.45 m 微孔滤膜滤过,分别用 100 L 进样器进样,定量环规格为20 L,依次上机进行测定。得到色谱图,依据相应色谱峰面积,外标一点法计算有效成分含量。4 结果与分析高效液相色谱法测定超声和回流两种不同方式炮制的地黄炮制品中梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛等 5 种成分含量,结果如表 3 所示。表 3 不同地黄炮制品中 5 种成分含量%样品提取方式梓醇地黄苷 A地黄苷 D毛蕊花糖苷5-羟甲基糠醛生地黄超声1.180.170.650.030.01熟地黄超声0.450.040.250.020.14生地炭超声0.770.140.530.030.21熟地炭超声0.400.060.230.020.23生地黄回流1.060.140.620.030.01熟地黄回流0.600.070.230.030.16生地炭回流0.600.120.480.030.23熟地炭回流0.310.100.200.020.294.1 梓醇含量由表 3 可知,各处理中地黄生品的梓醇含量均高于对应的熟品,炮制后地黄的梓醇含量均降低。超声处理地黄的梓醇含量均高于对应加热回流处理地黄的梓醇含量,超声处理 30 min 生地黄的梓醇含量最高(1.18%),而加热回流 1.5 h 熟地炭的梓醇含量最低(0.31%)。边宝林等6研究表明,不论是阴干还是晒干,地黄鲜品的梓醇含量下降都超过 1/3,而在 60 烘干时,地黄梓醇含量下降高达 44.1%。赵宇等7认为加热是地黄加工过程中梓醇含量下降的主要原因。武雯等8认为地黄的环烯醚萜苷类含量与 6-01王新民,等:怀地黄不同炮制品中 5 种成分差异的研究磷酸脱氢酶的活性有关,而加热影响 6-磷酸脱氢酶的活性,从而导致梓醇含量下降。本研究中,熟地黄、生地炭和熟地炭炮制过程均有高温加热步骤,梓醇受热发生分解或者改变,致使地黄炮制品梓醇含量降低。加热回流提取法,耗时费力,且梓醇测定结果偏低。建议在地黄药材有效成分含量测定时,采用超声法进行样品处理。4.2 地黄苷 A 和 D 含量甲醇超声制得的地黄炮制品中地黄苷 A 含量最高(0.17%),而熟地黄中含量最低(0.04%)。生地黄、生地炭中地黄苷 A 含量相近,熟地黄和熟地炭中地黄苷 A 含量相近。采取加热回流提取法,生地黄中地黄苷 A 的含量最高(0.14%),其次为生地炭,熟地黄最低(0.07%)。采取甲醇超声提取法,生地黄中地黄苷 D 含量最高(0.65%),生地炭次之(0.53%),熟地黄和熟地炭含量接近,生品中的含量均高于熟品。该结果与秦昆明等9的研究结果一致。王太霞等2研究发现,地黄苷 A 要比梓醇稳定,地黄苷 A 含量一般不低于 1.0 mg/g。卢鹏伟10测定了 8 个产地地黄中的地黄苷 D 含量,建议地黄苷 D 含量标准定为 0.15%。本研究所有样品中地黄苷 D 含量均高于 0.15%。4.3 毛蕊花糖苷含量超声提取制得的生地黄与生地炭中毛蕊花糖苷含量相同(0.03%),熟地黄与熟地炭中毛蕊花糖苷含量相同(0.02%)。加热回流制得的生地黄、熟地黄、生地炭中毛蕊花糖苷含量均为 0.03%,熟地炭中的含量为 0.02%,说明不同提取方法对毛蕊花糖苷含量影响较小,其值均大于或等于中华人民共和国药典(2020 版)的规定值(0.02%)。地黄炮制后的毛蕊花糖苷含量有所减少。马晓嘉11认为,地黄炮制中毛蕊花糖苷含量减少是由于部分键断裂而脱去官能团所致。王宏洁等12认为,生地黄炮制成熟地黄过程中要加热,而毛蕊花糖苷在加热过程中分子结构可能异构化为异毛蕊花糖苷。4.4 5-羟甲基糠醛含量超声和加热回流制得的熟地炭中 5-羟甲基糠醛含量均较高,分别为 0.23%和 0.29%,生地炭次之,分别为 0.21%和 0.23%,而生地黄最低。地黄经炮制后 5-羟甲基糠醛含量升高,与周丽等13的研究结果一致。宋志前等14指出 5-羟甲基糠醛是地黄炮制过程中 Maillard 反应的产物,因此,加热回流提取法获得的炮制品中 5-羟甲基糠醛含量较多。5 结论超声和加热回流两种提取方式下,生地黄中梓醇、地黄苷 A、D 和毛蕊花糖苷含量高于炮制后的熟地样品,而 5-羟甲基糠醛含量经炮制后均有增加。超声制得的地黄样品中梓醇、地黄苷 D 和毛蕊花糖苷含量均高于加热回流制得的地黄样品,而加热回流制得的地黄样品中 5-羟甲基糠醛含量高于超声制得的地黄样品。建议在测定地黄药材有效成分含量时,采用超声法进行样品处理。参考文献:1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)S.北京:中国医药科技出版社,2020,115-120.2 王太霞,李景原,胡正海.地黄的形态结构与化学成分研究进展J.中草药,2004,35(5):585-587.3 孔莹莹,张振凌,段卫娜,等.怀地黄有效成分梓醇的提取工艺和不同炮制品含量的比较研究J.中医学报,2013,28(181):865-867.4 李娴,王娜,卫向龙,等.生地炭、熟地炭炮制历史沿革及现代研究进展J.中华中医药学刊,2012,30(08):1737-1739.5 李计萍,马华,王跃生,等.鲜地黄与干地黄中梓醇、糖类成分含量的比较J.中国药学杂志,2001,36(05):14-16.6 边宝林,王宏洁,沈欣,等.鲜地黄及不同干燥条件下的生地黄中麦角甾甙的含量测定J.中成药,1997,19(8):20-21.7 赵宇,温学森,武卫红.地黄不同炮制品中梓醇含量分析现状 J.中 国 药 学 杂 志,2007,42(7):486-488,553.8 武雯,赵楠,李宏庆,等.地黄属资源植物中梓醇的分布及积累动态J.华东师范大学学报(自然科学版),2006(4):91-96.(下转第 17 页)11孙彦婷,等:猪 冠状病毒荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立及检测技术研究进展 J.养猪,2019,162(01):110-112.17 杜倩,汪伟,韩知晓,等.猪德尔塔冠状病毒 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 方法的建立及应用J.中国动物传染病学报,2021,29(02):15-21.18 辛佳亮,汪伟,杜倩,等.猪德尔塔冠状病毒 SYBR Green荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用J.中国兽医科学,2019,49(07):834-840.19 江珊,李富强,李秀丽,等.猪德尔塔冠状病毒 TaqMan荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用J.动物医学进展,2019,40(10):10-17.20 郑兰兰,朱静静,王盼,等.猪 冠状病毒 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