生物化学及分子生物学人卫第八版常用分子生物学技术的原理及应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

目录目录惯用分子生物学技术原惯用分子生物学技术原理及应用理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第二十章第二十章第第1页页目录目录第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique第第2页页目录目录核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，假假如如把把不不一一样样DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA单单链链分分子子之之间间有有一一定定碱碱基基配配对对关关系系，就就能能够够在在不不一一样样分分子子之之间间形形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术原理一、分子杂交与印迹技术原理第第3页页目录目录复性复性RNADNA第第4页页目录目录（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中生物大分子转利用各种物理方法使电泳胶中生物大分子转移到移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上墨迹，所以称一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上墨迹，所以称之为之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。第第5页页目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标识其用放射性核素、生物素或荧光染料标识其末端或全链已知序列多聚核苷酸链被称为末端或全链已知序列多聚核苷酸链被称为“探探针针”，探针能够与固定在，探针能够与固定在NC膜上核苷酸结合，膜上核苷酸结合，判断是否有同源核酸分子存在。判断是否有同源核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术第第6页页目录目录二、印迹技术类别及应用二、印迹技术类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern Blotting)（三）蛋白质印迹（三）蛋白质印迹(Western Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体分析。、重组质粒和噬菌体分析。用于用于RNA定性定量分析。定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第第7页页目录目录其它：其它：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)第第8页页三种印迹技术比较三种印迹技术比较第第9页页分子杂交试验分子杂交试验第第10页页目录目录放放射射自自显显影影照照片片第第11页页目录目录DNA点阵点阵第第12页页目录目录第二节第二节聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction第第13页页目录目录5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术工作原理技术工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 第第14页页目录目录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA含量能含量能够扩大够扩大100万倍以上。万倍以上。第第15页页目录目录模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+PCR体系基本组成成份体系基本组成成份第第16页页目录目录 PCR基本反应步骤基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第第17页页目录目录利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板取取得得已已知知目目标标基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直直接以组织和细胞接以组织和细胞mRNA为模板取得目标片段；为模板取得目标片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中取取得得序列相同基因片段；序列相同基因片段；利利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中克克隆隆基因。基因。二、二、PCR技术技术主要用途主要用途（一）目标基因克隆（一）目标基因克隆第第18页页目录目录利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA量量要要求求很很低低，是是DNA和和RNA微微量量分分析析最最好好方法。方法。（三）（三）DNA和和RNA微量分析微量分析（二）基因突变（二）基因突变第第19页页目录目录将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序序工作大为简化，也提升了测序速度；工作大为简化，也提升了测序速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定载载体体后后进进行序列测定，也可直接测定。行序列测定，也可直接测定。PCR与与其其它它技技术术结结合合能能够够大大大大提提升升基基因因突变检测敏感性突变检测敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析第第20页页目录目录逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA逆转录反应和逆转录反应和PCR反应联合应反应联合应用一个技术。用一个技术。RT-PCR是当前从组织或细胞中取得目标基因是当前从组织或细胞中取得目标基因以及对已知序列以及对已知序列RNA进行定性及半定量分析进行定性及半定量分析最有效方法。最有效方法。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几个主要三、几个主要PCR衍生技术衍生技术第第21页页目录目录原原位位PCR(in situ PCR)是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上单单个个细细胞胞内内进进行行PCR反反应应，然然后后用用特特异异性性探探针针进进行行原原位位杂杂交交，即即可可检检出出待待测测DNA或或RNA是是否在该组织或细胞中存在。否在该组织或细胞中存在。原原位位PCR方方法法填填补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术不不足足，是是将将目目标标基基因因扩扩增增与与定定位位相相结结合合一一个个最最正正确方法。确方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术第第22页页目录目录（三）实时（三）实时PCR技术技术实实时时PCR(real-time PCR)技技术术经经过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对对定量分析干扰，亦被称为定量定量分析干扰，亦被称为定量PCR。第第23页页目录目录实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标识引物荧光标识引物RQ 3355第第24页页目录目录第三节第三节核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis第第25页页目录目录核酸序列分析基本原理：核酸序列分析基本原理：化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链末端合成终止法链末端合成终止法(Sanger法法)第第26页页目录目录一、一、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法第第27页页目录目录GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddC链末端合成终止法测定链末端合成终止法测定DNA序列原理序列原理第第28页页目录目录二、二、DNA自动测序自动测序采采取取荧荧光光替替换换放放射射性性核核素素标标识识是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化基基础础。用用不不一一样样荧荧光光分分子子标标识识四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，经经过过四四种种激激光光激激发发不不一一样样大大小小DNA片片段段上上荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不一一样样波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基排列次序。碱基排列次序。第第29页页目录目录ddGddAddTddC红色红色荧光荧光绿色绿色荧光荧光黄色黄色荧光荧光蓝色蓝色荧光荧光电泳电泳DNA序列自动分析原理及结果图序列自动分析原理及结果图第第30页页目录目录第四节第四节基因文库基因文库Gene Library第第31页页目录目录基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列克隆群体。克隆群体。第第32页页目录目录一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物文库是指生物基因组基因组DNA信息信息（包含全部编码区和非编码区）以（包含全部编码区和非编码区）以DNA片段形片段形式贮存克隆群体。式贮存克隆群体。用于构建基因组文库载体有用于构建基因组文库载体有 噬菌体、粘噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粒和酵母人工染色体等。第第33页页目录目录基因组文库和基因组文库和cDNA文库构建和筛选文库构建和筛选第第34页页目录目录第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例第第35页页目录目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表示全部件下所表示全部mRNAmRNA经逆转录而合成经逆转录而合成cDNA序列序列克隆群体，它以克隆群体，它以cDNA片段形式贮存着该片段形式贮存着该组织细胞基因表示信息。组织细胞基因表示信息。二、二、cDNA文库文库第第36页页目录目录第五节第五节生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technique第第37页页目录目录是指将许多特定是指将许多特定DNADNA片段有规律地紧密排列片段有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上，然后与待测荧光标识固定于单位面积支持物上，然后与待测荧光标识样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，经过计算机系统对每一位点荧光信号进行扫描，经过计算机系统对每一位点荧光信号做出检测、比较和分析，从而快速得出定性和定做出检测、比较和分析，从而快速得出定性和定量结果。该技术亦被称作量结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)第第38页页目录目录基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图第第39页页目录目录是是将将高高度度密密集集排排列列蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕捉捉样样品品中中靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋白进行定性和定量分析一个技术。蛋白进行定性和定量分析一个技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间亲和反应蛋白质分子间亲和反应蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理第第40页页目录目录第六节第六节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study第第41页页目录目录一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选惯用蛋白质相互作用研究技术惯用蛋白质相互作用研究技术第第42页页目录目录标签融合蛋白结合试验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合试验是一个基于亲和色谱原理、分析蛋白质体外直接相互作用方法。原理、分析蛋白质体外直接相互作用方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合试验主要用于证实两种蛋标签融合蛋白结合试验主要用于证实两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合详细结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合合详细结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合未知分子。未知分子。第第43页页目录目录标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀试验流程试验流程示意图示意图第第44页页目录目录（二）酵母双杂交技术基本原理（二）酵母双杂交技术基本原理和用途和用途第第45页页目录目录酵母双杂交系统应用酵母双杂交系统应用证实两种已知基因序列蛋白质能够相互作用生证实两种已知基因序列蛋白质能够相互作用生物信息学推测。物信息学推测。分析已知存在相互作用两种蛋白质分子相互作分析已知存在相互作用两种蛋白质分子相互作用功效结构域或关键氨基酸残基。用功效结构域或关键氨基酸残基。将拟研究蛋白质编码基因与将拟研究蛋白质编码基因与BD基因融合成为基因融合成为“诱饵诱饵”表示质粒，能够筛选表示质粒，能够筛选AD基因融合基因融合“猎物猎物”基因表示文库，筛选未知相互作用蛋白质。基因表示文库，筛选未知相互作用蛋白质。第第46页页目录目录电电泳泳迁迁移移率率变变动动测测定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动试试验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与对对应应DNA序序列列间间相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究经经典典方方法法。当当前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序序列列间间相相互作用。互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定第第47页页目录目录放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白探针结合有蛋白探针标识探针标识探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标识探针未标识探针10X凝胶迁移试验结果示意图凝胶迁移试验结果示意图第第48页页目录目录染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是当当前前能能够够研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用主主要方法。要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法第第49页页目录目录染色质免疫沉淀试验流程及结果示意图染色质免疫沉淀试验流程及结果示意图第第50页页目录目录遗传修饰动物模型建立及应用遗传修饰动物模型建立及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七节第七节第第51页页目录目录转基因技术采用基因转移技术使目基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入目标基因被导入目标基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)目标基因受体动物目标基因受体动物一、转基因技术一、转基因技术第第52页页第第53页页目录目录n核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物一一个个体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体去去胞胞核核激激活活卵卵细细胞胞内内，使使之之发发育育成成个个体体，即即克克隆隆(clone)。二、核转移技术二、核转移技术第第54页页目录目录基因剔除技术基因剔除技术(gene knock out)也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)灭活，灭活，有目标去除动物体内某种基因技术。有目标去除动物体内某种基因技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术第第55页页目录目录将灭活基因放入胚胎干细胞将灭活基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)中，使这一灭活基因经过同源重中，使这一灭活基因经过同源重组取代原有目标基因，筛选到基因已定点灭活组取代原有目标基因，筛选到基因已定点灭活细胞后，经过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞后，经过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参加胚胎发育，最终形成嵌细胞在小鼠囊胚中参加胚胎发育，最终形成嵌合体小鼠。合体小鼠。操作方式操作方式第第56页页目录目录n建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除取得性突变取得性突变(gain-of-function mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学四、基因转移和基因剔除在医学发展中作用发展中作用第第57页页目录目录第八节第八节疾病相关基因克隆与判定疾病相关基因克隆与判定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第58页页目录目录功效克隆功效克隆(functional cloning)定位克隆定位克隆(positional cloning)克隆疾病相关基因策略克隆疾病相关基因策略第第59页页目录目录定义定义 从对一个致病基因功效了解出发来克隆从对一个致病基因功效了解出发来克隆该致病基因。该致病基因。（一）功效克隆（一）功效克隆应用应用 生化机制已明确、基因表示产物较易得生化机制已明确、基因表示产物较易得到部分纯化遗传性疾病。到部分纯化遗传性疾病。第第60页页目录目录利用酵母系统从功效学角度判定致病基因。利用酵母系统从功效学角度判定致病基因。用用不不一一样样人人DNADNA片片段段转转化化与与人人类类遗遗传传疾疾病病含含有有类类似似表表型型突突变变酵酵母母，能能够够恢恢复复(rescue)正正常常表表型型片片段段中中所所含含有有基基因因即即可可能能为为致致病病基基因因。这这种种试试验验称称为为功功效互补试验效互补试验 (functional complementation assay)。第第61页页目录目录（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一个致病基因染色体定位出发逐步缩小从一个致病基因染色体定位出发逐步缩小范围，最终克隆该基因。范围，最终克隆该基因。系统定位克隆工作系统定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基因分析、基因文库筛选与基因克隆文库筛选与基因克隆第第62页页目录目录基因诊疗和基因治疗基因诊疗和基因治疗第九节第九节Gene Diagnosis and Gene Therapy第第63页页目录目录定义定义直接检测基因结构及其表示水平是否正常，直接检测基因结构及其表示水平是否正常，从而对疾病作出诊疗方法。从而对疾病作出诊疗方法。一、基因诊疗一、基因诊疗(Gene Diagnosis)特点特点以基因作为检验材料和探察目标，属于以基因作为检验材料和探察目标，属于“病因诊疗病因诊疗”。针对特定基因，特异性强。针对特定基因，特异性强。所用技术含有放大效应，故诊疗灵敏度高。所用技术含有放大效应，故诊疗灵敏度高。适用性强，诊疗范围广。适用性强，诊疗范围广。第第64页页目录目录1.DNA序列分析序列分析用于基因突变类型已经明确遗传病诊疗用于基因突变类型已经明确遗传病诊疗及产前诊疗及产前诊疗 。2.PCR技术技术快速检出样品中痕量病原微生物。快速检出样品中痕量病原微生物。微量微量DNA 样品中基因及基因变异分析。样品中基因及基因变异分析。用于个体识别、亲缘关系判定、器官移植术用于个体识别、亲缘关系判定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。前组织配型、基因连锁分析等等。第第65页页目录目录样品中痕量病原微生物快速检出、分类及分型。样品中痕量病原微生物快速检出、分类及分型。同时分析样品中可能存在各种不一样基因变异方同时分析样品中可能存在各种不一样基因变异方式。式。分析样品中耐药菌株存在和个体对药品或毒物敏分析样品中耐药菌株存在和个体对药品或毒物敏感性。感性。分析个体疾病易感状态，如肿瘤、本身免疫病发分析个体疾病易感状态，如肿瘤、本身免疫病发生预警。生预警。3.基因芯片基因芯片(gene chip)第第66页页目录目录 将将某某种种遗遗传传物物质质转转移移到到患患者者细细胞胞内内，使使其其在在体体内内发发挥挥作作用用,以以治治疗疗疾疾病病方方法法，称称为基因治疗。为基因治疗。二、基因治疗二、基因治疗(Gene Therapy)定义定义第第67页页目录目录（一）基因治疗基本策略（一）基因治疗基本策略1.缺点基因准确原位修复基因增补缺点基因准确原位修复基因增补基因失活基因失活基因疫苗基因疫苗 基因矫正基因矫正基因置换基因置换第第68页页目录目录（二）基因治疗基本程序（二）基因治疗基本程序治疗性基因选择治疗性基因选择基因载体选择基因载体选择靶细胞选择靶细胞选择基因转移基因转移病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法第第69页页