基因综合项目工程知识要点.doc
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1、第一章1.基因工程:是在分子水平上进行遗传操作,指将一种或各种生物体(供体)基因或基因组提取出来,或者人工合成基因,按照人们愿望进行严密设计,通过体外加工重组,转移到另一种生物体(受体)细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新遗传性状技术。2.基因工程基本过程为哪些?切接转增检 获得目基因:从供体细胞分离出基因组DNA,用内切酶将外源DNA切开。切(同步选取运载目基因载体) 目基因与载体DNA拼接:用DNA连接酶将具有外源基因DNA片段接到载体分子上,形成DNA重组分子。 接 重组体分子导入受体细胞:借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。转 短时间培养转化细胞,以扩增DNA重组分子或使
2、其整合到受体细胞基因组中。 增 筛选和鉴定转化细胞,获得使外源基因高效稳定表达基因工程菌或细胞。 检3.哪些基因是真核生物特有? 假基因:核苷酸序列同其相应正常功能基因基本相似,但却不能合成出功能蛋白质失活基因。 基因家族:由功能有关基因成套组合形成 重复序列哪些是原核生物特有:插入序列。哪些是真核和原核共有:移动基因、重叠基因第二章1. 寄主细胞控制限制与修饰宿主控制限制核酸限制性内切酶宿主控制修饰修饰甲基转移酶以(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰现象。(简述寄主控制限制与修饰现象。v 大多数细菌噬菌体侵染都存在着某些功能性障碍。所谓寄主控制限制与修饰现象简称(R/M
3、体系)。R/M体系:寄主是由两种酶活性配合完毕一种是修饰甲基转移酶修饰 另一种是核酸内切限制酶限制R/M体系作用:v 保护自身DNA不受限制;v 破坏外源DNA使之迅速降解;2. 简述型、型和型核酸内切酶基本特性。(1)型酶基本特性 有内切酶活性和甲基化酶活性互斥 需要ATP、SAM(S腺苷甲硫氨酸)和Mg 2+辅助因子; EcoB和EcoK是由三种不同亚基构成。多肽链:特异性亚基,辨认DNA序列活性。多肽链:修饰亚基,具备甲基化酶活性。多肽链:限制亚基:具备核酸内切酶活性 有特定辨认位点 切割方式:结合在辨认位点,以滚环形式沿着DNA分子转位,从距辨认位点5 一侧几千bp处随机切割分子,无特
4、异性。(2) 型酶:有内切酶活性和甲基化酶活性分开反映能辨认专一核苷酸序列,并在固定位置上切割辨认序列核苷酸对顺序呈回文构造(那项具备回文构造:辨认位点DNA序列呈双重旋转对称 )切割可形成两种核苷酸切割末端粘性末端和平末端。粘性末端定义 :指DNA分子在限制酶作用下形成具备互补碱基单链延伸末端构造,能通过互补碱基间配对而重新环化起来。(3)型酶: 由两个亚基构成蛋白质复合物,即同步具备内切酶活性和甲基化酶活性 需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子可辨认特定碱基顺序,并在这一顺序3端24 26bp处切开,因此它切割位点也是没有特异性4. 同尾酶:指来源不同、辨认靶序列不同但产生相似粘性末端核酸
5、内切酶。运用同尾酶可使切割位点选取余地更大。同裂酶:指来源不同但辨认相似靶序列核酸内切酶。同裂酶进行同样切割,产生同样末端。但有些同裂酶对甲基化位点敏感性不同。星号活性:同一限制酶当某些反映条件变化时酶专一性发生变化,即酶切位点专一性变化活性。包装上标“”注明。5.DNA缺口平移、取代反映概念DNA缺口平移:在DNA分子单链缺口上,DNA聚合酶5 3核酸外切酶活性和聚合伙用可以同步发生。(概念:当外切酶活性从缺口5一侧移去一种5核苷酸之后,聚合酶作用就会在缺口3一侧补上一种新核苷酸,但Pol不能在3-OH和5-P之间形成一种键,随着5一侧核苷酸不断移去, 3一侧核苷酸又按序列增补,缺口便沿着D
6、NA分子合成方向移动。) 用途:通过DNA缺口转移,制备供核酸分子杂交用带放射性标记DNA探针。取代反映:如果在反映混合物中仅存在一种dNTP,则此酶35 外切酶活性将从ds DNA3端降解,直到互补于该dNTP碱基浮现为止,然后在该位置发生合成和取代反映。6.各DNA聚合酶基本特性及其区别;(1)大肠杆菌DNA聚合酶(Pol)酶活性 5 3聚合酶活性:需Mg2+ 5 3外切酶活性:可以从游离5-OH末端水解DNA分子(修复作用) 3 5外切酶活性(较低):从DNA链3-OH末端向5水解DNA(校对作用)用途:重要功能参加DNA合成,起到修复作用;Pol同DNA分子克隆关系最为密切。(2)Po
7、lKlenow片断 53聚合酶活性; 35 外切酶活性 无53 外切酶活性。Klenow片断重要用途: 修补经限制酶消化DNA所形成3隐蔽末端; 标记DNA片断末端; cDNA克隆中第二条链cDNA合成; DNA序列测定。(3)Pol(参加DNA修复过程)酶活性: 53聚合酶活性:规定模板是双链DNA,中间有空隙单链DNA某些,且空隙某些不长于100 bp; 具备35 外切酶活性,无53 外切酶活性; 重要在DNA损伤修复中有一定作用(4)Pol 聚合伙用:是细胞内DNA复制所必须; 35 外切酶活性,底物是单链DNA; 53 外切酶活性,底物是单链DNA。(5)T4 DNA聚合酶 53聚合酶
8、活性; 35 外切酶活性; 无53 外切酶活性; 取代反映:在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸暴露时停止;(6)T7 DNA聚合酶 53聚合酶活性; 35 外切酶活性(是klenow片段1000倍); 无53 外切酶活性;(7)耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)(选取题) 具耐高温特性,最适活性温度为72,持续保温30min仍有活性,一次加酶即可满足PCR反映全过程需求; Mg 2+依赖酶;具备聚合酶活性;具备53 外切酶活性,无35 外切酶活性 SDS完全抑制其酶活性。(8)反转录酶依赖RNADNA聚合酶。 多肽链具备反转录酶活性和RNase H活性; 多肽链具备以RNA-DNA杂
9、交分子为底物53脱氧核酸外切酶活性。 以mRNA为模板合成cDNA;在反转录酶作用下,水解掉RNA链,再以cDNA为模板合成第二条cDNA。7.连接酶所需条件供能分子、磷酸基团和羟基。概念:可以催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键酶。即可以将DNA链上彼此相邻3-羟基( OH )和5-磷酸基团(-P),在供能分子作用下,形成磷酸二酯键。需要三种成分参加:3-OH,5-P,提供能量分子供能分子:NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核酸)在E.coli等细菌中选用ATP(腺苷三磷酸)动物细胞、噬菌体中选用注: 只能连接缺口(nick); 不能连接裂口(gap); 并且被连接DNA链必要是双螺旋DNA分子一某些。
10、8.缺口:在双链DNA某一条链上两个相邻核苷酸之间失去磷酸二酯键所浮现单链断裂。裂口:在双链DNA某一条链上失去一种或数个核苷酸所形成单链断裂。9、碱性磷酸酶:将DNA末端5端磷酸基除去,使其5端变成3羟基,能防止自身环化。作用:(1)去除DNA和RNA5”-磷酸基,然后在T4多聚核苷酸激酶催化下,用32PATP进行末端标记,继而进行序列分析。(2)去除载体DNA5”-磷酸基,防止自身环化,减少本底,提高重组DNA检出率。 发夹构造:10、末端转移酶特性: 催花dNTP添加到3-OH端,且不需模板; 需Co 2+。用途: 给载体或cDNA加上互补同聚尾; 标记3末端。第三章1、基因载体:离开染
11、色体外源DNA不能复制,而插入外源DNA可作为复制子一某些在受体细胞中进行复制,这种复制子就是外源基因载体。 2、报告基因:有特殊意义基因,重组子转入宿主细胞中,可根据报告基因从其她细胞中辨认区别甚至挑选出来。2、载体应具备特性: 能在宿主细胞内进行独立和稳定DNA自我复制,插入外源基因后,仍保持稳定复制状态; 易于从宿主细胞中分离,并行纯化; 载体DNA序列中有单一酶切位点,并位于DNA复制非必须区内; 具备可以观测表型特性,如报告基因(遗传标记),插入外源DNA后,这些特性可以作为重组DNA选取标志。3、载体致死效应:运用载体进行克隆时,有时也许对大量克隆化基因和克隆化基因产物也许有害,宿
12、主细胞呈现致死效应。如大量表达目蛋白不利于宿主繁殖,使其致死。3、R1质粒和Col E1-K30质粒R1质粒Col E1-K30E.Coli中严紧型松弛型奇异变形杆菌中松弛型严紧型4、质粒构型:常用构型:SC L OCA. 共价闭合环形DNA(cccDNA):呈现超螺旋SC构型B. 开环DNA(ocDNA):即OC型。C. 线性DNA(lDNA):即L型。依照寄主细胞所含拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。5、质粒种类F质粒:又叫F因子、性质粒或致育质粒。是最具代表性单拷贝接合型质粒,共编码着19个转移基因。R质粒:又称抗药性因子,它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。Col质粒:产生大肠杆菌素因
13、子,编码有控制大肠杆菌素合成基因。属非结合质粒。6、Col E1质粒迁移作用:由共存接合型质粒引起非接合型质粒转移过程。其中参加迁移有两种基因:bom 基因:位于Col E1DNA上特异位点mob 基因:Col E1质粒特有,其编码核酸酶作用于bom位点7、细菌质粒不相容性在同一种大肠杆菌细胞,普通不能同步具有两种不同质粒。也称为质粒不亲和性。是指在没有选取压力状况下,两种亲源关系密切不同质粒,不可以在同一种寄主细胞系中稳定地共存现象。8、质粒报告基因应用类型:插入失活效应;互补简述如何应用插入失活和-互补(蓝白筛选)来筛选重组子pBR322质粒载体有:抗氨苄青霉素基因(ampr);抗四环素基
14、因(tetr) 互补:LacZ(半乳糖苷酶基因)有两个重要亚基,亚基 和 亚基, 与 相结合就能体现出半乳糖苷酶活性,能将无色底物X-Gal 变成蓝色。片段基因coli基因组 - 肽基因质粒 将具有- 肽质粒转化到coli上( - 互补),形成蓝色菌落; 插入外源基因,使- 肽编码区被破坏,LacZ失活则形成白色菌落。 运用- 互补(蓝白斑筛选)进行重组子筛选。9、如何对质粒进行人工改造,使其成为载体。(1)减小分子量:可容纳外源DNA更长;(2)改造内切酶位点,具备若干限制酶切单一位点多克隆位点(人工合成且密集排列);(3)插入外源基因后,较易导入宿主菌内复制和表达,且不会因接触而转移到另一
15、种细菌;(4)具备一种或几种报告基因。克隆载体:复始起始点、遗传标记、多克隆位点10、pBR322和pUC质粒各构成某些来源分别是什么?(1)pBR322重要构成某些来源 亲本:pMB1和pSF2124 ; ampr基因来源于pSF2124; tetr基因来源于Psc101; 复制起点(ori)Col E111、穿梭质粒:是指一类由人工构建具备两种不同复制起点和选取记号,因而可在两种不同寄主细胞存活和复制质粒载体。专 题 核酸分子提取及核酸凝胶电泳2、简述提取质粒DNA 原理及环节。碱变性法原理:运用染色体DNA与质粒DNA变性与复性差别而达到分离目。环节:材料准备 破碎细胞或包膜,使内容物释
16、放 核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸,去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中3、如何防止RNase污染? 塑料器皿用0.1%DEPC水溶液浸泡12h以上,高温灭菌后,180烘干6h以上。 在超净工作台上操作。 操作时带一次性手套和口罩。 提取缓冲液中加入RNase抑制剂。1、温和噬菌体:既可引起宿主细胞裂解死亡,又可将其核算整合到细菌染色体上,使细菌细胞继续生长繁殖,并被溶溶原化噬菌体。 烈性噬菌体:将噬菌体感染记住细胞转变成为噬菌体“制造厂”,能产生出大量子代噬菌体。溶原化:用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌过程。噬箘粒:由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成新型载体系列,称为噬菌粒载体。柯
17、斯质粒:一类由人工构建具有DNAcos序列和质粒复制子特殊类型质粒载体。载体,也称粘粒、柯斯载体。4、PAGE、琼脂糖凝胶电泳和脉冲电泳区别及其应用范畴。电泳技术用途区别琼脂糖凝胶电泳检测总DNA或总RNA完整性、对PCR产物进行检测以及对核酸进行回收和纯化辨别100bp50kb核酸片段聚丙烯酰胺凝胶电泳生物多样性检测以及亲子鉴定等辨别1bp1000bp核酸片段脉冲电场凝胶电泳分离大分子量DNA分子辨别 50kb核酸片段2、噬菌体繁殖方式 溶菌性方式:噬菌体运用宿主酶类和原料,DNA复制成子代DNA,并装配呈子代噬菌体,最后裂菌,释放出许多新噬菌体。 溶源性方式:感染过程中没有产生出子代噬菌体
18、颗粒,噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上,成为细菌DNA一种构成某些。3、噬菌体类型及体外包装程序(二)体外包装程序 包装反映底物,按照滚环复制机理合成多连体形式DNA,在具备噬菌体头部前体条件下,从cos位点处被切割成单体分子。 将线性单体分子装填到头部外壳里,由于具备粘性末端而发生环化。 把头部和分别组装尾部构造连成一体,形成成熟噬菌体颗粒。4、M13 载体长处和用途;长处: 只含单链DNA,因而可用作对DNA测序模板及其他基因克隆实验,如异源双链DNA分析,互补RNA分离及DNA序列分析等; 可用来产生单链DNA探针以选取和分离互补RNA; RF型是双链DNA,便于限制酶辨认和切
19、割; RF型DNA经包装后分泌到细胞外而不溶菌; 不存在包装限制问题。用途: 制备测序用单链DNA模板; 用于制备杂交探针; 用于定点突变。6、质粒、 噬菌体和柯斯质粒包装限制。(1)噬菌体包装能力控制在为野生噬菌体DNA长度(约48.5 kb)75%-105%。 蛋白质外壳容纳DNA能力 噬菌体载体克隆外源DNA能力(2)柯斯质粒:可运用噬菌体体外包装特性进行体外包装,运用噬菌体感染方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体,而是以质粒DNA形式存在于细胞内。克隆外源基因可达45kb,比噬菌体大许多。由于包装限制缘故,存在最低限值(30kb)。:噬箘粒特点: 噬菌粒载体分子量较小,
20、约3000bp; 既有质粒复制起点又有噬菌体复制起点。在寄主内,可以按正常双链质粒DNA形式复制,形成双链DNA既稳定又高产,具备常规质粒特性(选取性标记、多克隆位点等 在辅助噬菌体存在下,可进行噬菌体繁殖,产生单链子代噬菌体,包装成噬菌体颗粒后被挤出寄主细胞。 用噬箘粒克隆DNA进行测序,免除从质粒到噬菌体这一亚克隆环节。(分子量小、克隆能力大;能稳定遗传;可用来制备单、双链DNA。)(一)聚合酶链式反映(PCR)1、 原理:双链DNA分子在临近沸点温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子,然后DNA聚合酶以单链DNA为模板,引物与互补DNA结合后,经单链杂交复性,并运用反映混合物中四种脱氧
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