HPLC法测定十三味逐瘀合剂中游离大黄酚含量.pdf

法测定十三味逐瘀合剂中游离大黄酚含量基金项目:百色市科学研究与技术开发计划项目(百科)第一作者简介:邓凤云男副主任药师医学学士研究方向:医院药学、医院制剂开发:.本文引用格式邓凤云王建芳吴显兴等.法测定十三味逐瘀合剂中游离大黄酚含量.右江医学():.邓凤云王建芳吴显兴韦贤罗试计姜攀(.广西百色市中医医院.药剂科.骨伤科.壮医学科广西百色.右江民族医学院药学院广西百色)【摘要】目的 建立十三味逐瘀合剂中大黄酚高效液相含量测定的方法 方法 采用高效液相色谱法(法)对十三味逐瘀合剂中游离大黄酚含量进行测定从提取溶剂、取样量、提取时间等影响因素中选出最优条件建立完整的含量测定方法 结果 用 色谱柱(.)以甲醇.磷酸(/)为流动相采用等度洗脱法 波长的色谱条件以甲醇为浸膏提取溶剂超声 的提取方法大黄酚质量浓度在./(.)范围内具有良好的线性关系平均回收率为.测得十三味逐瘀合剂中游离大黄酚平均含量为./结论 本实验所建立的方法操作简单专属性强重现性好可用于十三味逐瘀合剂中游离大黄酚的含量测定【关键词】十三味逐瘀合剂含量大黄酚高效液相色谱法中图分类号:.文献标志码:./.(.)【】.().(.).(/)./(.)./.【】()十三味逐瘀合剂是在百色市中医医院名老中医协定处方的基础上开发而来处方由酒制大黄、柴右江医学 年第 卷第 期 .胡、川芎、桃仁、红花、天花粉、当归、甘草、延胡索、土鳖虫、茯苓、泽泻、桔梗十三味中药组成具有荡涤凝瘀败血、活血化瘀、消肿止痛等作用临床主要用于治疗肋骨骨折并胸腔积液 处方中大黄、柴胡为君药具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、疏肝行气等功效两药合用一升一降以攻散胁下之瘀滞而桃仁、红花为臣药具有活血化瘀、消肿止痛的功效川芎和土鳖虫可活血祛瘀当归补血活血天花粉既能入血分助诸药而消淤散结又可清热润燥延胡索行气止痛茯苓、泽泻、桔梗均可利水消肿、通调水道以上共为佐药甘草可缓急止痛调和诸药是为使药 处方中君臣佐使的相辅相成使十三味逐瘀合剂功效极佳 我国药典中记载大黄为蓼科植物掌叶大黄 .、唐古特大黄 .?.或药用大黄 .的干燥根和根茎 大黄的化学成分主要包含蒽醌衍生物、番泻叶苷、等此外还含有鞣质类、有机酸类、挥发油类及植物甾醇等 而蒽醌类是其主要的药理活性成分分别以游离型和结合型存在游离型有大黄素、大黄酚、大黄酸等 高效液相色谱法()具有精密度高、重复性好、分辨度高等优点故本课题运用高效液相色谱法进行游离大黄酚的含量测定对十三味逐瘀合剂的质量标准的研究进行初步探索 实验试剂与材料.仪仪器器高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司型号 )十万分之一电子分析天平梅 特 勒托 利 多 仪 器(上 海)有 限 公 司 型 号数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司型号)数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司型号)超纯水仪(成都优越科技有限公司型号 ).试试剂剂 试剂均为色谱纯甲醇(成都市科隆化学品有限公司)磷酸(成都金山化学试剂有限公司)超纯水 对照品:大黄酚对照品(纯度:批号 厂家:成都乐美天医药科技有限公司)供试品:十三味逐瘀合剂(批号:)为本实验室根据处方自行制备 方法与结果.色色谱谱条条件件 色谱柱为 色谱柱(.)以甲醇.磷酸(/)为流动相等度洗脱流速为./检测波长 柱温 进样量 .溶溶液液的的配配制制.十十三三味味逐逐瘀瘀合合剂剂的的制制备备方方法法将柴胡、川芎、桃仁、红花、天花粉、当归、甘草、延胡索、土鳖虫、茯苓、泽泻、桔梗等药材按处方配比共 加药材重量的 倍水煎煮 加入大黄后再煎煮 过滤药渣再加入 倍水煎煮 将两次煎煮所得煎煮液混合即得.对对照照品品溶溶液液的的制制备备称取大黄酚对照品.精密称定置于.容量瓶中加入甲醇至刻度线称重超声 再用甲醇滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过取续滤液制成每 含大黄酚.的对照品溶液备用使用时用甲醇稀释成不同浓度的标准溶液.供供试试品品溶溶液液的的制制备备 浸膏得率:将十三味逐瘀合剂(批号:)各 置蒸发皿中水浴蒸干后置烘箱中 干燥至恒重计算三批样品平均得率为.量取十三味逐瘀合剂 置蒸发皿中水浴蒸干后得浸膏 将浸膏研细称取浸膏.精密称定置于.容量瓶中加入甲醇至刻度线称重超声 再用甲醇滴加至刻度线制成每 约含浸膏.的供试品溶液经.微孔滤膜滤过取续滤液备用.阴阴性性样样品品溶溶液液的的制制备备按处方比例称取缺大黄的其他药材按“.”项下制备方法制备大黄阴性样品按照“.”项下制备方法制备阴性样品溶液备用.空空白白溶溶剂剂的的制制备备 取甲醇适量经.微孔滤膜滤过取续滤液备用.系系统统适适应应性性实实验验 精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液、色谱甲醇各 按照“.”项下的色谱条件测定峰面积记录色谱图 由图谱数据可知在该色谱条件下大黄酚的特征吸收峰与其他吸收峰均能较好分离大黄酚在 附近出现特征吸收峰无干扰阴性样品无干扰峰溶剂无干扰峰 结果见图 图 右江医学 年第 卷第 期 .图 对照品 图 图 供试品 图图 阴性样品 图 图 甲醇 图.单单因因素素实实验验.提提取取溶溶剂剂主要考察不同的提取溶剂对浸膏中大黄酚提取程度的差异本实验采用三种提取溶剂进行考察方法如下:取十三味逐瘀合剂浸膏.三份精密称定分别置于 个.容量瓶中分别加入甲醇、甲醇水(/)、甲醇水(/)至刻度线称重超声 再用相同溶剂滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过取续滤液按照“.”项下的色谱条件测定峰面积每组进样两次并记录峰面积 由实验结果可知三种溶剂中甲醇提取大黄酚的提取率最高故选择甲醇作为提取溶剂 实验结果见表 表 提取溶剂单因素实验结果提取溶剂取样量()平均峰面积大黄酚含量(/)大黄酚提取率()甲醇.甲醇水().甲醇水().取取样样量量主要考察不同的取样量对实验结果的影响本实验采用三种浓度进行考察方法如下:称取十三味逐瘀合剂浸膏.精密称定分别置于 个.容量瓶中分别加入甲醇至刻度线称重超声 再用甲醇滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过取续滤液按照“.”项下的色谱条件测定峰面积每组进样两次记录峰面积 实验结果见表 各取样量 图见图 图 由实验结果及 图可知取样量为.提取较为完全峰形较佳且分离度较好故选用.样品作为取样量.提提取取时时间间主要考察不同的提取时间对有效成分提取程度的差异本实验采用三种不同的提取时间进行考察方法如下:取十三味逐瘀合剂浸膏.三份精密称定分别置于三个.容量瓶中加入甲醇至刻度线称重分别超声 、右江医学 年第 卷第 期 .、再用甲醇滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过取续滤液按“.”项下的色谱条件测定大黄酚峰面积每组进样两次 由实验结果可知超声时间对大黄酚提取成分程度没有明显差异为提取完全故选择超声 作为提取方式 由单因素实验结果可知对浸膏提取时提取溶剂为甲醇取样量为.提取时间为 时对大黄酚的提取较为完全故采用此方法进行溶液的制备实验结果见表 表 取样量单因素实验取样量()平均峰面积大黄酚含量(/).图 取样量.图 图 取样量.图 图 取样量.图表 提取时间单因素实验结果提取时间()取样量()平均峰面积大黄酚含量(/)大黄酚提取率().标标准准曲曲线线制制备备和和线线性性关关系系考考察察分别配制./././././的对照品溶液按照“.”项下的色谱条件测定峰面积大黄酚进样浓度为横坐标并以峰面积为纵坐标绘制标准曲线计算的回归方程.结果显示大黄酚在./范围内具有良好的线性关系 标准曲线见图 图 大黄酚标准曲线.精精密密度度实实验验精密量取大黄酚对照品溶液 置于.容量瓶中加入甲醇至刻度右江医学 年第 卷第 期 .线称重超声 再用甲醇滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过取续滤液按照“.”项下的色谱条件测定峰面积连续测定 次记录峰面积并计算出 次实验的 值为.小于结果表明仪器精密度良好.稳稳定定性性实实验验 取同一供试品溶液室温下放置、后按照“.”项下的色谱条件测定峰面积每组进样两次记录峰面积计算其 值为.表明供试品溶液在 内稳定性良好.重重复复性性实实验验称取十三味逐瘀合剂(批号:)按“.”项下制备浸膏 称取该浸膏.共 份精密称定分别置于 个.容量瓶中分别加入甲醇至刻度线称重超声 再用甲醇滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过取续滤液按照“.”项下的色谱条件测定峰面积每组进样两次记录峰面积计算大黄酚的含量得 值为.小于 结果表明该方法重复性良好 实验结果见表 .加加样样回回收收实实验验取 份已知含量的十三味逐瘀合剂(批号:)的浸膏.精密称定分别置于 个.容量瓶中精密量取含大黄酚.的对照品溶液分别加入以上 份供试品浸膏中分别加入甲醇至刻度线称重超声 再用甲醇滴加至刻度线经.微孔滤膜滤过按照“.”项下的色谱条件测定峰面积计算回收率和 最 终 得 大 黄 酚 的 平 均 加 样 回 收 率 为.值为.小于 结果表明该方法回收率良好 实验结果见表 表 重复性实验结果()编号取样量()平均峰面积大黄酚含量(/)大黄酚平均含量(/).表 加样回收实验结果()编号取样量()样品含量()加入量()测得量()加样回收率()平均回收率().样样品品含含量量测测定定取 批十三味逐瘀合剂(批号:)按“.”项制备供试品溶液并按“.”项下色谱条件进行进样计算其含量结果 批样品浸膏中大黄酚的平均含量分别为./././均值为./根据浸膏得率换算每 十三味逐瘀合剂中平均含大黄酚()为.讨 论 本次实验最终确定了十三味逐瘀合剂中游离大黄酚用 法含量测定的最佳条件:色谱柱为 色谱柱(.)以甲右江医学 年第 卷第 期 .醇.磷酸(/)为流动相等度洗脱流速为./检测波长 柱温 进样量 浸膏取样量为.提取溶剂为甲醇提取方式为超声 实验结果显示所建立的含量测定方法能有效地分离出大黄酚成分且本方法的专属性、线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率均良好且符合中国药典的规定故将此方法用于十三味逐瘀合剂中游离大黄酚的含量测定在 测定大黄酚含量过程中进行流动比例考 察 时 发 现 比 例 为 甲 醇.磷 酸 溶 液(/)时分离度较差目标成分大黄酚的吸收峰与杂质峰难以分开比例为甲醇.磷酸溶液(/)时分离度好无杂质干扰 在系统性实验中发现大黄酚对照品 图稍有拖尾现象可能是因为色谱柱使用时间较长导致色谱柱性能下降 在取样量单因素考察中发现浸膏取样量在.时大黄酚的吸收峰位置往后移洗脱时间延长可能与环境温度及流动相中有机相与水相的比例有关参 考 文 献 张飞龙.温热药(方)在温病治疗中运用的研究.南京:南京中医药大学.孙守祥.大黄的外治功效及经验配伍.时珍国医国药():.王立雪刘婷回连强等.大黄对大鼠解热作用及其药效物质基础研究.中国中药杂志():.张桥陈艳琰乐世俊等.大黄炮制的历史沿革及对化学成分、传统药理作用影响的研究进展.中国中药杂志():.袁名扬周学刚扈丹丹等.基于网络药理学及分子对接探讨柴胡当归 药对治疗乳腺增生的作用机制.药学研究():.杨宇史昌乾佟杰.羟基红花黄色素 镇痛作用及机制初步研究.中南药学():.王建.临床中药学.北京:人民卫生出版社.柴士伟.虫类药物治疗类风湿性关节炎的研究进展/中华中医药学会 年药房管理分会学术年会论文集:.陈斯.延胡索化学成分和药理作用研究进展.中医药信息():.朱永康.朱永康效方治验 解毒利湿汤(合剂).江苏中医药():.高晓娟赵丹赵建军等.甘草的本草考证.中国实验方剂学杂志():.国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版一部.北京:中国医药科技出版社:.孙汉青李锦萍刘力宽等.大黄化学成分与药理作用研究进展.青海草业():.高亮亮.唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄的化学成分和生物活性研究.北京:北京协和医学院.张开弦姚秋阳吴发明等.大黄属药用植物化学成分及药理作用研究进展.中国新药杂志():.()():.戴胜云詹书怡欧阳晓婕等.基于不确定度轮廓的大黄 定量分析方法验证研究.药物分析杂志():.(收稿日期:修回日期:)(编辑:王琳葵 梁明佩)右江医学 年第 卷第 期 .