花青素提取.doc

桑椹酒渣中花青素提取
1材料与方法
1.1材料
桑椹果酒酒渣。
1.2试剂药品
试验所用95%乙醇、浓盐酸、30%过氧化氢、Na2SO3等试剂均为分析纯。
1.3主要仪器
电子分析天平、分光光度计、旋转蒸发仪、酸度计、高速冷冻离心机、电热恒温水浴锅等。
1.4方法（稀HCl+95%乙醇提取）
样品称量，用提取剂提取，过滤（减压过滤/板框过滤），所得的提取液按一定比例稀释（pH1.0氯化钾缓冲液和pH4.5醋酸钠缓冲液稀）释后在分光光度计上测出OD值，以OD值代表桑椹红色素的含量。
1.4.1不同溶剂的吸光光谱及提取效果比较
分别以75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1）、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1）作为提取剂，以物料与提取剂之比1：10提取桑椹色素，提取液经3倍稀释后用分光光度计测定各提取液吸收光谱。
1.4.2不同物料与提取剂之比对花青素提取的影响（此时用提取效果最好的提取剂）。
1.4.3温度对提取效果的影响
以最佳结果作为桑椹提取剂，分别于60、50、40、30、20℃下提取1h。
1.4.4提取时间对提取效果的影响
每隔20分钟取样测得OD值。
1.4.5正交实验
1.4.6得率试验
称取一定量样品，经提取后。提取液经旋转蒸发仪蒸发，真空干燥，求得率。

方法一稀HCl+95%乙醇提取
1不同溶剂的吸光光谱及提取效果比较
固定浸提温度、提取时间、液料比，分别85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1）、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1）、0.15%稀HCl +95%乙醇（1：1）为提取剂进行浸提试验，色
素提取液分别采用pH1.0氯化钾缓冲液和pH4.5醋酸钠缓冲液稀释一定倍数(吸光值在0.2~0.8之间)，将稀释液静置15min，分别测定两种样品稀释液ODλmax和700nm处的吸光值A。按公式计算桑椹花色苷含量，分析提取溶剂对花色苷提取量的影响。
注：ODλmax 的确定分别以85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1）、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1）、0.15%稀HCl +95%乙醇（1：1）作为提取剂，以物料与提取剂之比1：10提取桑椹色素，提取液经3倍稀释后用分光光度计测定各提取液吸收光谱。
2不同物料与提取剂之比对花青素提取的影响（此时用提取效果最好的提取剂）。
分别称取2.0g酒渣，按液料比5、10、15、20、25、30加入相应体积的浸提溶剂，在40℃下避光提取2h后，抽滤、离心(3000rpm，10min)。取1mL清液，用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对液料比作图，分析液料比对色素提取量的影响。
3温度对提取效果的影响
分别称取2.0g酒渣置入5个50mL的三角瓶中，各加入浸提溶剂，搅拌5 min，用封口膜将瓶口密封并用铝箔纸包裹好以避光。分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴上提取2h后，抽滤、离心(3000rpm，10min)。取1mL上清液，用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对温度作图，分析温度对色素提取量的影响。
4提取时间对提取效果的影响
每隔30分钟取样测得OD值。用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对时间作图，分析提取时间对色素提取量的影响。
5桑椹红色素酸性乙醇溶剂提取条件的正交试验
根据单因素试验的结果，选取L9(34)正交试验表，以浸提溶剂中乙醇浓度、浸提时
间、浸提温度、液料比为因素，安排4水平做正交试验，以确定提取的最佳条件。
方法二超声波辅助提取桑椹红色素
1超声波功率对红色素提取的影响
精确称取2.0g桑椹酒渣若干份，按液料比？分别加入？提取液，在30℃温度下，分别以200～700 W超声功率萃取20min。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲液稀释(吸光值控制在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对超声功率作图，分析功率对色素提取量的影响。
2超声温度对色素提取量的影响
精确称取2.0g桑椹酒渣若干份，按液料比？分别加入？提取液，以？W超声功率分别在20～60℃温度下萃取20min。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm姗处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对超声温度作图，分析温度对色素提取量的影响。
3超声时间对色素提取量的影响
精确称取2.0g桑椹酒渣若干份，按液料比？分别加入？提取液，在？℃温度下，以？W超声功率分别萃取5、10、15、20、25、30min。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对超声时间作图，分析时间对色素提取量的影响。
4桑椹红色素超声波辅助提取条件的正交试验
根据单因素试验的结果，选取L9(34)正交试验表，以超声功率、超声温度、超声时间为因素，安排3水平做正交试验，以确定提取的最佳条件。
方法三微波辅助提取桑椹红色
选择微波辅助提取温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃ , 以微波功率500W、600W、700W、800W、900W,微波辐射时间2S、4S、6S、8S、10S以及液料比10:1、20:1、30:1、40:1、50:1为单因素考察因素.
选择其中重要的3因素进行正交实验。

最后HPLC分析：
将三种方法所得到的产品进行HPLC分析，看其活性物质是否有变化，主要是后面两种方法是否对活性物质改变。

方法三超高压辅助提取桑椹红色
1 压力对色素提取量的影响
精确称取2.0g桑椹酒渣若干份放入超高压处理袋内，按液料比？分别加入？提取液，封口包装；以不同压力100～500MPa进行加压3min，加压1次的处理。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对高压压力作图，分析压力对色素提取量的影响。
2 加压时间对色素提取量的影响
精确称取2.0g桑椹酒渣若干份放入超高压处理袋内，按液料比？分别加入？提取液，封口包装；分别以加压时间l～5min进行300MPa，加压1次的高压处理。抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对加压时间作图，分析时间对色素提取量的影响。
3加压方式—间歇式对色素提取量的影响
精确称取2.0g桑椹酒渣若干份放入超高压处理袋内，按液料比？分别加入？提取液，封口包装；分别加压1次(300MPa处理3min)、加压2次(300MPa处理1.5min，卸压，再300MPa处理1.5min) 、加压3次(300MPa处理1min，卸压，再300MPa处理1min，再300MPa处理1min)。 抽滤、离心得到色素粗提液，用pH1.0和pH4.5缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对加压次数作图，分析结果。
方法四加入酶对红色素提取的影响
未加酶；果胶酶0.1%；纤维素酶.01%；果胶酶0.05%+纤维素酶0.05%。
测定花色苷含量的方法有很多，经典的有薄层层析法、快速测定比色法、紫外吸收光谱
(UV)等，现代的有红外吸收光谱、液相色谱(HPLC)以及核磁共振(NMR)、质谱(FAB)等。除紫外吸收分光光度法外，其余方法均需要标准色素样品，测定的是某种花色营的具体含量。这对于尚未确定组成的新样品的初步研究是一个难题，也给一般性的检验分析带来了困难。
花色苷是水溶性色素，根据比尔定律，溶液的浓度与其吸光度A成正比，因此在未有标准品时，可用紫外-可见吸收分光光度法测定总花色苷的含量。花色苷含量主要有2种表示方法：色价及代入消光系数用公式计算。由此可见，关键是吸光值A的测定。综合国内外资料，主要有以下几种计算吸光值A的方法：
(1)当叶绿素是该样品中主要存在的干扰色素时，需消除叶绿素吸收含量的影响；此时，计算公式为：
A=(Amax－A620) －0.1(A650－A620)
国内已有用此方法测定苹果果皮表面及山植果实中花色苷含量的报道。
(2)含有其它干扰物质时花色苷总量的测定:
直接法：在新鲜的植物提取物中，因为很少含有在花色营的最大吸收区发生吸收的干扰
物质，花色苷总量可以直接由可见区最大吸收波长处的吸光度来测定。计算公式为：
A=Amax
pH示差法：在食品加工或储藏过程中，会产生褐色降解物，这些降解物和花色普具有相同的能量吸收范围。这类花色苷总量的测定，通常用pH示差法。计算公式为：
A=(Amax－A700)pH1.0－(Amax－A700)pH4.5
本研究通过两种分光光度方法测定桑堪果汁中花色昔的含量，运用数学统计分析，比较得出了适合于桑椹中花色苷测定的简便、准确的方法，从而为其他样品花色苷含量的测定提供了一般性思路。本实验样品采用的是桑椹果酒酒渣进行试验，故只需采用pH示差法来测定总花色苷含量。
在食品加工或贮藏过程中，会产生褐色降解物，这些降解物和花色苷具有相同的能
量吸收范围，这类花色苷总量的测定，通常采用pH示差法，计算公式为：
A=(Amax－A700)pH1.0－(Amax－A700)pH4.5
测定方法：将色素提取液，分别采用pH1.0氯化钾缓冲液和pH4.5醋酸钠缓冲液稀释一定倍数(吸光值在0.2～0.8之间)，并且将稀释液静置15min，达到动态平衡后，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A。
参考植物生理学实验指及冯建光pH示差法测定葡萄皮红色素含量的方法，以及结合霍琳琳等采用分光光度法测定桑椹花色苷含量，得到提取液中总花色苷含量的计算公式：

式中：V一提取液总体积(mL)；
n一稀释倍数；
M—Cy-3-glu的分子量(449．2)；
ε一Cy-3-glu的消光系数，其值为26900；
m一原料的重重(g)

红色素稳定性研究
1 pH值对色素颜色的影响
用柠檬酸、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠调色素溶液的pH值为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、
7.0、8.5，室温下用色差计观察溶液颜色变化，分析pH值对色素颜色的影响。
2热对色素稳定性的影响
取pH为？的色素稀释液100mL于30、40、60、80、90、100℃的恒温水浴中加热，隔一定时间，测定色素溶液在ODλmax处的吸光度值，分析热对色素稳定性的影响。
3光对色素稳定性的影响
取pH值为？的色素稀释液100mL分别置于直射光、室内散射光下，隔一定时间测定色素溶液在ODλmax处的吸光度值，分析光对色素稳定性的影响。
4糖对色素稳定性的影响
配制pH为？的含有不同浓度的葡萄糖、蔗糖的色素稀释液，隔一定时间，测定色素溶液在ODλmax处的吸光度值，分析糖对色素稳定性的影响。
5防腐剂对色素稳定性的影响
配制含有不同浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾的pH为？的色素稀释液，隔一定时间，测定色素溶液在ODλmax下的吸光度值，分析防腐剂对色素稳定性的影响。
6氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响
配制含有不同浓度的亚硫酸钠和过氧化氢的pH为？的色素稀释液，隔一定时间，测定色素溶液在ODλmax处的吸光度值，分析亚硫酸钠和过氧化氢对色素稳定性的影响。
7金属离子对色素稳定性的影响
配制含有不同浓度的K+、Ca2＋、Na＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Fe3＋、Mn2＋、Ba2＋、Sn2+、Al3+的pH为？的色素稀释液，隔一定时间，观察颜色变化，测定色素溶液在ODλmax处的最大吸光值，分析不同浓度的金属离子对色素稳定性的影响。
桑椹红色素抗菌性研究
1分析桑椹红色素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的抑制作用。
2分析桑椹红色素对各种细菌的抑制作用研究

注：还可以考虑怎样把桑椹红色素提纯。