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U2BL调控拟南芥下胚轴伸长的机制研究.pdf
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1、DOI:10.11913/PSJ.2095-0837.23065张婉露,丁勇.U2BL 调控拟南芥下胚轴伸长的机制研究J.植物科学学报,2024,42(1):6674Zhang WL,Ding Y.Regulation of hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.by U2BLJ.Plant Science Journal,2024,42(1):6674U2BL 调控拟南芥下胚轴伸长的机制研究张婉露,丁 勇*(中国科学技术大学生命科学学院,合肥 230026)摘要:下胚轴的伸长在植物早期存活和后期生长发育过程中均具有重要作用
2、。本研究对拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)突变体进行了筛选,得到了具有短下胚轴表型的突变体 u2bl,并对其下胚轴变短机制进行了初步研究。结果显示,突变体 u2bl 在不同光照条件下均表现出下胚轴较短的表型。细胞学实验表明,突变体u2bl 下胚轴细胞长度的降低是其下胚轴较短的原因。赤霉素(GAs)是促进下胚轴伸长的主效应因子。但 u2bl突变体对外源 GA 处理及内源 GA 合成抑制剂多效唑(PAC)处理均不敏感,表明 U2BL 基因可能影响 GA 的信号转导。亚细胞定位结果表明,U2BL 在细胞核中富集。荧光定量 Q-PCR 分析结果显示,在 u2bl 突
3、变体中,PRE1、SAUR16、YUC2、YUC8 和 PIF4 等基因的表达均有显著下调,U2BL 可能通过调控上述基因来间接调控下胚轴的伸长。本研究结果为进一步探讨 U2BL 在拟南芥生长发育及在其他物种中可能行使的功能提供了参考。关键词:U2BL 基因;拟南芥;下胚轴;赤霉素中图分类号:Q943.2文献标识码:A文章编号:2095-0837(2024)01-0066-09Regulation of hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.by U2BLZhang Wanlu,Ding Yong*(School of Li
4、fe Sciences,University of Science and Technology of China,Hefei 230026,China)Abstract:Hypocotyl elongation is essential for early survival and later growth and development in plants.Inthis investigation,we examined and screened Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.mutant phenotypes,identifyingthe u2bl vari
5、ant with a notable short hypocotyl.We also conducted preliminary studies on the role of U2BL inthe regulation of hypocotyl development in A.thaliana.The u2bl mutant showed a short hypocotyl phenotypeunder different light conditions.Cytological experiments showed the shorter cell length of hypocotyls
6、 in theu2bl mutant was the reason for its short hypocotyl phenotype.The plant hormone gibberellin(GAs)is the mainfactor promoting hypocotyl elongation,while paclobutrazol(PAC)is an endogenous GA synthesis inhibitor.Our study showed that the u2bl mutant was not sensitive to exogenous GA treatment or
7、PAC treatment,indi-cating that U2BL affected GA signal transduction.Subcellular localization results indicated that U2BL was en-riched in the nucleus.Furthermore,Q-PCR assay showed that the transcription levels of PRE1,SAUR16,YUC2,YUC8,and PIF4 genes were all significantly down-regulated in the u2bl
8、 mutant,suggesting that U2BLmay indirectly regulate hypocotyl elongation by regulating the above genes.Our study provided a referencefor further research on the possible functions of U2BL in the growth and development of A.thaliana and otherspecies.Key words:U2BL gene;Arabidopsis thaliana;Hypocotyl;
9、GA 收稿日期:2023-07-06,接受日期:2023-09-25。基金项目:国家自然科学基金项目(32000242)。作者简介:张婉露(1997),女,硕士研究生,研究方向为拟南芥生长调控机制(E-mail:)。*通信作者(Author for correspondence.E-mail:)。植物科学学报2024,42(1):6674Plant Science Journalhttp:/ 植物的一生通常要经历种子萌发、营养生长、生殖生长到结实形成新种子的过程。在萌发过程中,植物需要钻出土层,转至地上生长,同时伴随着异养生长向光合自养的转变,而下胚轴的伸长在其中起到了决定性作用。下胚轴过短会
10、导致植物无法破土,过长则会造成植物徒长,影响后期生长。因此,下胚轴伸长对于植物的生长发育来说至关重要,研究下胚轴伸长的分子机制具有重要现实意义。下胚轴伸长作为植物破土成功并开始光合作用的关键节点,受到多种因素的调控1。外界环境因素(如光、温度)以及内源植物激素(如赤霉素(GAs)、生长素和乙烯等)均可调控下胚轴的伸长。植物可通过整合各种调节信号,使下胚轴恰当地伸长,以保证其正常生长发育。在拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)中,光敏色素、隐花色素以及向光素作为主要的光受体负责感知不同波长的光。光敏色素包括PHYTOCHROMES(PHYs,PHYAPHYE),
11、主要负责感知红光与远红光;隐花色素包括 UV RE-SISTANCE LOCUS 8(UVR8)和CRYP-TOCHROMES(CRYs、CRY1 和 CRY2),主要负责感知 UV-A 和蓝光;向光素包括 PHOTO-TROPINS(PHOT1 和 PHOT2),主要感知蓝光信号2,3。这些光受体被激活后,通过传递不同的光信号从而促进拟南芥幼苗的光形态建成,其特征是抑制下胚轴伸长,促进子叶伸展和花青素积累4,5。隐花色素 CRYs 蛋白可以与泛素连接酶CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC1(COP1)及 其 增 强 子 SUPRESSOR OF PHYA-105 1
12、(SPA1)蛋白发生相互作用,抑制 COP1-SPA1 复合物的活性,促进 COP1 的底物(如HY5/HYH 和 CONSTANS)的蛋白积累,从而抑制蓝光条件下的下胚轴伸长6-8。光敏色素以两种不同的光转换形式存在,分别为非活性红光吸收形式 Pr 以及活性远红光吸收形式 Pfr9。PHYB 是介导红光抑制下胚轴伸长的主要感受器10。PHY-TOCHROME INTERACTING FACTORs(PIFs)作为 PHYB 的关键直接下游组分,介导光信号通路,以抑制光形态建成11,12。已经证实,PHYB 的信号传导机制与 PIFs 的红光依赖性存在相互作用,导致 PIFs 的快速磷酸化以及
13、随后的泛素化和降解13-15,从而抑制下胚轴的伸长。热形态发生是指植物响应环境温度的升高而发生的形态变化,其特征是下胚轴、叶柄和根组织明显伸长、气孔密度降低和提早开花16-18。PIF4 被认为是环境高温调控下胚轴伸长的关键枢纽,PIF4 可直接结合在生长素合成基因 YUCCA8(YUC8)、TRYPTOPHAN AMINOTRANS-FERASE OF ARABIDOPSIS 1(TAA1)及 CY-TOCHROME P450 FAMILY 79B 2(CYP79B2)等的启动子区域,以促进下胚轴和叶柄的伸长19。赤霉素是一种四环双萜类化合物,主要存在于高等植物细胞的质体及内质网20,21。
14、迄今为止,在植物、真菌和细菌中已发现 130 多种 GAs,但只有 GA1、GA3、GA4和 GA7具有生物活性22。赤霉素被认为存在于所有维管植物中。在低等植物如石松和蕨类植物中,GAs 参与生殖发育23;在高等植物中,GAs 的功能已扩展到通过增强细胞伸长和/或细胞分裂来促进器官生长24。作为一种重要的植物激素,GAs 在种子萌发、幼苗生长发育及果实成熟等重要生理过程中发挥关键作用25。GA 信号通路的核心阻遏因子为 DELLA 蛋白。DELLA 蛋白与 PIF4 互作,阻止 PIF4 与其目标基因的启动子结合。赤霉素通过对 DELLA 蛋白的降解,解除 DELLA 对 PIF4 的转录抑
15、制作用,来促进下胚轴的伸长26,27。GA 受体 GIBBERELLIN IN-SENSITIVE DWARF1(GID1)是在对 GA 不敏感矮稻突变体的研究中首次发现的28。拟南芥中有 3个 GID1 直系同源基因,分别为 GID1A、GID1B和 GID1C29,它们在调控不同发育过程中既有重叠又有不同的功能30-32。目前的模型表明,活性GA 与 GID1 结合后,诱导 GID1 蛋白构象转变,产生可与 DELLA 蛋白结合的疏水表面,促进GID1-GA-DELLA 蛋白复合体的形成,进而导致DELLA 蛋白构象改变,促进 DELLA 蛋白 C 端与E3 泛素连接酶 SCFSLY1/G
16、ID2/SNE相互作用,使之被泛素化,最后通过 26S 蛋白酶体途径降解。DEL-LA 抑制因子在 GA 作用下降解,从而促进或抑制下游基因表达,调节细胞长度,促进下胚轴的伸长33。RNA 结合蛋白(RBP)是与核糖核酸(RNA)分子结合的蛋白质,通常在细胞质和细胞核中发现,并在形成核糖核蛋白(RNPs)中起重要作用。第 1 期张婉露等:U2BL 调控拟南芥下胚轴伸长的机制研究67RBP 在真核生物的多个发育过程中发挥着中心调节作用34,35。在拟南芥中,RBP 已被证明影响花的转变、干细胞维持、侧根形成、下胚轴伸长和根毛形成等生长发育过程36。U2B是一类重要的RBP 蛋白,已有研究表明 U
17、2B蛋白定位于 Cajalbody,而 U2BL(U2B-LIKE)是一类与 U2B蛋白高度同源的蛋白质37。目前关于 U2BL 在植物生长发育进程中的功能还知之甚少,对其亚细胞定位情况也不清楚。仅有研究表明,植物中 U2BL 可能调控植物对低温的生理反应38。本研究通过对拟南芥突变体表型的观察,发现 u2bl 功能缺失突变体具有下胚轴较短的表型,表明 U2BL 可能调控拟南芥下胚轴伸长这一生长发育过程。为了进一步探索 U2BL 调控拟南芥下胚轴伸长的机制,我们对 u2bl 突变体进行了不同浓度的 GA 及 GA 合成抑制剂多效唑(PAC)处理,发现 u2bl 突变体对 GA 及 PAC 处理
18、均不敏感,暗示U2BL 调控拟南芥下胚轴的伸长过程且参与 GA 信号转导途径。本研究旨在进一步理解 U2BL 在植物生长发育过程中行使的功能,并丰富植物生长发育的调控网络。1材料与方法 1.1材料拟 南芥 u2bl-1(SALK_064334C)和 u2bl-2(SALK_013395C)突变体订购于 Arashare(中国拟南芥突变体服务中心)。rga(SALK_089146),gai(SALK_587_C02)和rgl1(SALK_136 162)由本实验室保存。1.2实验方法 1.2.1下胚轴长度统计对拟南芥种子进行无菌处理。用双蒸水清洗3 遍后,加入 75%的乙醇溶液浸泡 5 min,
19、再用双蒸水清洗 3 遍;移至超净台加入 10%的 Bleach 溶液浸泡 7 min;除去 Bleach 溶液后,加入灭菌双蒸水清洗种子,每次 2 min,清洗 7 次。将种子均匀地点在固体 1/2 MS 培养基中,于超净台中吹干后密封,置于 4 冰箱中两天,再放入不同条件下生长 7 d。用镊子将待测幼苗平铺在固体培养基中,置于体视镜下测量其下胚轴长度。1.2.2GA 与 PAC 敏感性实验对干燥的种子进行无菌处理。将其均匀地点在含有不同浓度 GA(0、0.5、1、2、5 mol/L)或 PAC(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L)的固体 1/2 MS 培养基
20、上,置于 4 冰箱中处理 2 d,再放入长日照条件下生长 7 d 后测量下胚轴长度。1.2.3亚细胞定位对于转基因植株,首先构建 35S:mCherry-U2BL 载体,通过农杆菌介导法将其转入野生型Col-0 植株,获得 U2BL 过表达转基因株系。收获种子后,进行无菌处理,置于 1/2 MS 平板上生长7 d。将幼苗置于激光共聚焦显微镜下,将激发光和发射光波长分别设为 593 nm 和 610 nm,观察荧光信号在根尖细胞的定位。对于原生质体,首先构建 U2BL-RFP 载体,提取高纯度质粒,用拟南芥幼苗叶片制备原生质体,将目的质粒转入原生质体,黑暗中培养 12 h。向原生质体中加入适量核
21、染料 DAPI,混匀后置于荧光共聚焦显微镜下观察蛋白定位情况。1.2.4基因型鉴定本研究所用突变体均为 T-DNA插入突变体。用于鉴定 T-DNA 插入突变体的引物均可从网站(http:/signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html#open-newwindow)根据突变体的编号进行检索。拟南芥突变体的基因型鉴定可以使用三引物法和两引物法进行鉴定。本研究所用引物见表 1。1.2.5RNA 提取和 Q-PCR 分析在预冷研钵中分别加入突变体 u2bl-1、u2bl-2和野生型 Col-0 的新鲜叶片材料,研磨后加入1 mL 预冷的 Trizol 溶液;将研钵中的液体转移至
22、RNase-free 的 EP 管中,加入 300 L 氯仿,混匀后静置 3 min;吸取上清至新的 EP 管中,加入400 L 异丙醇,混匀后,室温静置 30 min;离心后弃上清,用 DEPC 水配制的 75%乙醇洗涤;将EP 管中残留的液体吹干,加入 30 L DEPC 水后使用 HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR反转录试剂盒,将纯化所得的 RNA 反转录为cDNA。利用表 1 中的相关引物,以拟南芥 cDNA 为模板,分别扩增内参基因(TUBULIN)和待检测靶基因,根据琼脂糖凝胶电泳检测结果调整模板比例,在保证待鉴定材料内参基因的电泳结果一致
23、的情况下,进行半定量 RT-PCR 分析,凝胶电68植 物 科 学 学 报第 42 卷泳后,对比待检测基因的亮度,初步判断基因的表达情况。进一步使用诺唯赞公司的 SYBR qPCR Mas-ter Mix 试剂盒进行荧光定量 Q-PCR 分析。反应体系为:10 L Mix,0.4 L 引物 1,0.4 L 引物 2,3 L 模板,6.2 L 水。每个样品 3 个重复。扩增程序为:95 预变性 3 min;95 变性 10 s,56 退火 30 s,72 延伸 30 s,共 40 个循环;融解曲线所用程序为:95 预变性 10 s,65 退火 5 s,下个循环预变性温度不变,退火温度依次加 1,
24、共 31 个循环。以 UBQ10 为内参,通过 2Ct法计算基因的相对表达量。1.3数据处理采用 Excel 2016 软件对数据进行整理,使用SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析,利用 Excel2016 软件进行作图。图表中数据均为平均值 标准差(mean SD),统计显著性水平设置为 P0.05。2结果与分析 2.1u2bl 突变体表型观察本研究获得了 2 个 T-DNA 插入突变体,分别为 u2bl-1(SALK_064334C)和 u2bl-2(SALK_013395C)。图 1:A 为 U2BL 基因的结构示意图。如图所示,突变体 u2bl-1 的 T-DNA 插入于 5 U
25、TR区域,突变体 u2bl-2 插入于基因的第 1 个内含子区域。基因型鉴定表明,u2bl-1 和 u2bl-2 均为T-DNA 插入突变体(图 1:B)。半定量 RT-PCR实验结果进一步验证,u2bl-1 和 u2bl-2 均为功能缺失突变体(图 1:C)。将 Col-0、u2bl-1 和 u2bl-2 材料分别置于 1/2 表 1实验所用引物Table 1Primers used in this study引物Primers序列(53)Sequence(53)LP1AGTTCTGCATCTGACGGACAGRP1CGGCGAGATAGACACTCAGACLP2AAAAGGGGAAAGAG
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