PCR标准体系优化.docx
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1、因为Taq DNA聚合酶是现在PCR反应体系中应用最广泛酶,所以此文关键讨论使用该酶PCR反应体系。A 镁离子浓度镁离子是热稳定DNA聚合酶辅因子,其浓度对PCR至关关键。模板DNA浓度,鳌合物(如EDTA和柠檬酸盐)、dNTP浓度和蛋白全部会影响反应体系中游离镁离子量。假如游离镁离子含量不够,那么Taq DNA聚合酶则无法行使功效(figure1)。过多游离镁离子则会降低酶保真度,可能会增加非特异性扩增。所以,研究者应该依据实际试验结果来优化每一反应中镁离子浓度。能够用一系列镁离子浓度梯度来验证,镁离子浓度范围为14mM,每次增加或降低0.51 mM。扩增产量最高,非特异性产物最低时镁离子浓
2、度即为最优。最优镁离子浓度范围跟DNA聚合酶类型相关,比如,Pfu DNA 聚合酶似乎对镁离子依靠性更低,但其优化范围通常为26mM。很多DNA聚合酶产品提供Mg-free reaction buffer和单独一管25mM MgCl2,这么就能够自行调整Mg2+浓度,优化反应体系。MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层,为取得均一溶液,在配液时候,要确保MgCl2溶液完全溶解并充足震荡混匀。很简单两步,溶解和混匀,常常会造成试验失败。有些科学家倾向于使用包含MgCl2buffer,MgCl2终浓度为1.5mM。值得注意是有文件报道发觉使用这类buffer结果并不稳定,有时体系内游离镁离子浓度
3、会有0.6mM改变,假如在90加热10min,则结果趋于稳定,所以作者假设反复冻融buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。Figure 1.镁离子浓度对PCR扩增影响。用不一样浓度 Mg 2+测试,产物大小为1.8kb琼脂糖凝胶电泳,EB染色泳道M为MAKER; Lane 1, 0mM Mg 2+ ; Lane 2, 0.5mM Mg 2+ ;Lane 3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1.5mM Mg 2+ ; Lane 5, 2mM Mg 2+ ; Lane6, 2.5mM Mg 2+ ; Lane 7, 3mM Mg 2+ and Lane 8, 3.5mM Mg 2+
4、B Buffer 缓冲液大多数Buffer里含有一个缓冲试剂,多数为基于Tris缓试剂。另外还有盐类,通常为KCL。缓冲试剂调整反应体系pH值,pH值会影响DNA聚合酶活性和保真度。和不添加KCL比,适量KCL能够增加5060%DNA聚合酶活性。通常来说,KCL浓度为 50mM。C 酶浓度我们推荐(promega科研人员)在50微升体系中使用1-1.25units Taq DNA聚合酶。多数情况下,这些酶是过量,再添加酶并不能显著提升产物量。实际上,酶量不停升高会增加Taq DNA聚合酶53外切酶活性,跑胶时候会观察到弥散条带。想要正确吸收少许含50%甘油酶溶液是很困难,所以提议一次配置大量预
5、混液,这么酶加量便会很大,降低误差。D PCR 引物设计引物决定扩增区域和扩增子大小,引物长度通常在1530bp。理想状态下引物其GC含量应该在4060%,避免在引物3端出现三个连续G或C以降低非特异性结合。还要避免本身或引物间互补,以降低引物二聚体。引物本身二级机构干扰退火时引物和模板结合。正反向两条引物之间Tm值相差不超出5,方便两条引物在同一退火温度下拥有相同扩增效率。能够在引物上添加其它用途序列,比如在5端添加酶切位点序列,方便下一步克隆,或添加T7 RNA聚合酶开启子,方便进行体外转录。实际应用中会发觉不一样软件给出Tm值不一样,同一软件不一样参数得出Tm值也不一样。无须纠结于此,只
6、需要使用同一个软件统一参数去评定一个项目中所用引物就好,Tm值只是一个相正确标准,不管哪种软件只要你全部引物全部在一个标准体系内评定,不会影响后续试验分析。就好比你带两块表反而不知道具体时间,只需要有一个标准参考体系即可。E 模板质量扩增依靠DNA模板数量和质量。核酸纯化过程中常常使用试剂(盐类、胍、蛋白酶、有机溶液和SDS)是潜在DNA聚合酶抑制剂。比如0.01% SDS会造成90% Taq DNA聚合酶活性被抑制,而0.1% SDS则会抑制99.9%Taq DNA聚合酶活性。其它PCR抑制剂有苯酚、肝素、二甲苯蓝、溴酚蓝、植物多糖和多胺类物质精胺和亚精胺。有些情况下,抑制剂并不是伴随核酸模
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