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限制性内切酶的应用.ppt
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1、限制性内切酶的应用限制性内切酶的发现v 30多年前,当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵,而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA,产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。v 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候,以NEB为代表的许多公司寻找更多的限制性内切酶限制性内切酶的特点v 限制性内切酶的形式多样,从大小上来说,它们可以小到如Pvu II(157个氨基酸),也可以比1250个氨基酸的Cje I更
2、大v 除了某些病毒以外,限制性内切酶只在原核生物中被发现v 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中,已发现了超过250种的特异识别序列。限制性内切酶的主要功能v 保护细菌不受噬菌体的感染,这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时,大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用;而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。v 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破
3、坏v 限制性内切酶和它的搭档-甲基化酶一起就构成了限制-修饰(R-M)系统。在一些R-M系统中,限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白,它们各自独立行使自己的功能;而在另一些系统中,两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基,或是同一亚基的不同结构域来执行限制性内切酶的命名 限制性内切酶命名的次序如下:v A)用3个字母代表来源的生物(如Bam代表 Bacillus amyloliquefaciens)v B)1个字母或阿拉伯数字代表菌株(BamH)v C)1个罗马字母代表发现或鉴定的次序(BamHI)限制性内切酶的分类v 按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类v I型限制性内
4、切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管I型酶在生化研究中很有意义,但由于不产生确定的限制片段和明确的电泳条带,因而不具备实用性。限制性内切酶的分类v II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带,因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成,因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上,从已知的情况上看,这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的,而非来源于同一个祖先。限
5、制性内切酶的分类v III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链,并且要求识别位点是反向重复序列;它们很少能产生确定的切割片段,因而不具备实用价值,也没有人将其商业化。II型限制性内切酶的分类(一)v 内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上,因而识别的是对称序列;但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上,识别非对称序列。一些酶识别连续的序列(如EcoR I识别GAATTC);而另一些识别不连续的序列(如Bgl I识别GCCNNNNN
6、GGC)。限制性内切酶的切割后产生一个3羟基端和一个5磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在,而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小,亚基一般都在200-300个氨基酸左右。II型限制性内切酶的分类(二)v IIS型酶,比如Fok I和Alw I,它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中,约为400-650个氨基酸左右;它们识别连续的非对称序列,有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上,但与临近的酶结合成二聚体,协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时,活性可能更高。II型限制性
7、内切酶的分类(三)v 第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶,通常由850-1250个碱基组成,在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列,并在识别位点的一端切开DNA链;而另一些酶识别不连续的序列(如Bcg I:CGANNNNNNTGC),并在识别位点的两端切开DNA链,产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同,但其结构组成是一致的。他们在N端有一个负责切开DNA的功能域,这个域又与DNA修饰域连接;此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端,或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时,它们
8、或行使限制性内切酶的功能切开底物,或作为修饰酶将其甲基化。一些概念v粘末端和平末端v同尾酶v同裂酶v同识异切酶v消化v星号活力同裂酶:有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同,其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时,一种限制性内切酶可以切割,另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5CCGG3,如果其中有5-甲基胞嘧啶,则只有Hpa能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶和同尾酶:有时两种酶切割序列不完全相同,但却能产生相同的粘性末端,这类酶被称为同尾酶,可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来,但原来的酶切位点将被破坏,有时可能会产生一个新的酶
9、切位点。如Xba(TCTAGA)、Nhe(GCTAGC)、Spe(ACTAGT)切割的DNA序列不同,但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后,以上的酶将不能再切割,但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点,即 Bfa(CTAG)的酶切位点。同尾酶:限制性内切酶的应用v克隆(有时与甲基化酶联用)v鉴定(基因片断大小、正反向)v检测突变 (识别位点,限制酶切图谱的多态性)v 制作Marker单酶切与双酶切的选择策略运用载体的限制载体的自身环化(挑选阳性克隆的工作量)克隆的方向(鉴定)InsertEcoR1Xho11.9kb质粒质粒该实验用质粒pCMV-Myc-T10经EcoR单酶切后应
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