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染色质免疫沉淀分析ChIP技术简介 染色质免疫沉淀分析ChIP 技术简介（Chromatin Immunoprecipitation Assay，ChiP）（Abcam 公司和Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品）染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA 与蛋白质互相作用重要工具。它可以敏捷地检测目的蛋白与特异DNA 片段结合状况，还可以用来研究组蛋白与基因表达关系。核小体组蛋白可以发生各种翻译后共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因表达密切有关。依照“组蛋白密码”假说，组蛋白各种共价修饰组合会以协同或拮抗方式诱导特异下游生物学功能，因而，ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中作用，全面阐明真核基因表达调控机制提供了强有力研究工具。真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响，所有信号传递途径终点都是DNA。DNA 通过核蛋白复合物构成染色质，染色质是基因调控一种重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子研究显示存在一种新调节机制-“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白转录后修饰等过程中。该类修饰涉及组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心构造区域和羧端修饰拟定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中作用越来越明确。参加修饰酶依照其作用不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记相应于不同生物学过程，它可以作为调节因子作用位点，也可以用来变化染色质构造。染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来办法，它基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范畴内染色质小片段，然后通过免疫学办法沉淀此复合体，特异性地富集目蛋白结合DNA 片段，通过对目片断纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA 互相作用信息。它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上调控蛋白，是当前拟定与特定蛋白结合基因组区域或拟定与特定基因组区域结合蛋白质一种较好办法。CHIP 不但可以检测体内反式因子与DNA动态作用，还可以用来研究组蛋白各种共价修饰与基因表达关系。并且，CHIP 与其她办法结合，扩大了其应用范畴：CHIP 与基因芯片相结合建立CHIP-on-chip 办法已广泛用于特定反式因子靶基因高通量筛选；CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中作用。由此可见，随着CHIP 进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要作用。凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）是当前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合惯用办法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相似DNA 结合位点，这种体外分析获取成果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA 结合状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来办法，它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上调控蛋白，是当前拟定与特定蛋白结合基因组区域或拟定与特定基因组区域结合蛋白质最佳办法。ChIP 技术和芯片技术结合有助于拟定全基因组范畴内染色体蛋白分布模式以及组蛋白修饰状况。ChIP 基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完毕一种染色质免疫沉淀分析。染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA互相作用一种技术。它运用抗原抗体反映特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合状况。特别是近年来由于该技术不断发展和完善，其应用范畴已经从研究目蛋白与已知靶序列间互相作用，发展到研究目蛋白与整个基因组未知序列互相作用；从研究一种目蛋白与DNA互相作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合互相作用；从研究启动子区域组蛋白修饰，发展到研究结合在DNA序列上蛋白复合物。随着对基因功能研究不断进一步，这项技术正越来越多被应用于科研各个领域。当前已有成熟ChIP试剂盒出售，如Millipore公司提供EZ-ChIP试剂盒，使得越来越多研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域获得了成功。染色质免疫沉淀技术原理是：在生理状态下把细胞内DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶解决将染色质切为小片段后，运用抗原抗体特异性辨认反映，将与目蛋白相结合DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术普通涉及细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反映逆转，DNA纯化，以及DNA鉴定。由于ChIP实验涉及环节多，成果重复性较低，因此对ChIP实验过程每一步都应设计相应对照，并且对成果分析也需要有一定经验。对于刚刚开始使用ChIP技术研究人员来说，使用成熟商品化试剂盒和有关技术服务会达到事半功倍效果，例如Millipore公司EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计入门产品。它原理是在保持组蛋白和DNA联合同步，通过运用相应于一种特定组蛋白标记生物抗体，染色质被切成很小片断，并沉淀下来。IP是运用抗原蛋白质和抗体特异性结合以及细菌蛋白质“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白FC片段现象活用开发出来办法。当前多用精制prorein A预先结合固化在argarosebeads上，使之与具有抗原溶液及抗体反映后，beads上prorein A就能吸附抗原达到精制目。实验最需要注意点就是抗体性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反映。建议仔细检查抗体阐明书。特别是多抗特异性是问题。另一方面，要注意溶解抗原缓冲液性质。多数抗原是细胞构成蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必要要使其溶解。为此，必要使用具有强界面活性剂缓冲液，尽管它有也许影响一某些抗原抗体结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其他蛋白结合成果，抗原决定族被封闭，影响与抗体结合，虽然IP成功，也是诸多蛋白与抗体共沉悲惨成果。再次，为防止蛋白分解，修饰，溶解抗原缓冲液必要加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，一方面考虑抗体/缓冲液比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质互相作用重要工具。它可以敏捷地检测目的蛋白与特异DNA片段结合状况，还可以用来研究组蛋白与基因表达关系。核小体组蛋白可以发生各种翻译后共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因表达密切有关。依照“组蛋白密码”假说，组蛋白各种共价修饰组合会以协同或拮抗方式诱导特异下游生物学功能，因而，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中作用，全面阐明真核基因表达调控机制提供了强有力研究工具。真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响，所有信号传递途径终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物构成染色质，染色质是基因调控一种重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子研究显示存在一种新调节机制-“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白转录后修饰等过程中。该类修饰涉及组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心构造区域和羧端修饰拟定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中作用越来越明确。参加修饰酶依照其作用不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记相应于不同生物学过程，它可以作为调节因子作用位点，也可以用来变化染色质构造。 染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来办法，它基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范畴内染色质小片段，然后通过免疫学办法沉淀此复合体，特异性地富集目蛋白结合DNA片段，通过对目片断纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA互相作用信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上调控蛋白，是当前拟定与特定蛋白结合基因组区域或拟定与特定基因组区域结合蛋白质一种较好办法。CHIP不但可以检测体内反式因子与DNA动态作用，还可以用来研究组蛋白各种共价修饰与基因表达关系。并且，CHIP与其她办法结合，扩大了其应用范畴：CHIP与基因芯片相结合建立CHIP-on-chip办法已广泛用于特定反式因子靶基因高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中作用。由此可见，随着CHIP进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要作用。 凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）是当前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合惯用办法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相似DNA结合位点，这种体外分析获取成果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来办法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上调控蛋白，是当前拟定与特定蛋白结合基因组区域或拟定与特定基因组区域结合蛋白质最佳办法。ChIP技术和芯片技术结合有助于拟定全基因组范畴内染色体蛋白分布模式以及组蛋白修饰状况。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完毕一种染色质免疫沉淀分析。 ChIP（染色质免疫沉淀）实验办法1. Cross-linking and cell harvesting1.1. Start with two confluent 150 cm2 dishes (1107- 5107 cells per dish). Cross-link proteins to DNA by adding formaldehyde drop-wise directly to the media for a final concentration of 0.75% and rotate gently at room temperature (RT) for 10 min.*1.2. Add glycine to a final concentration of 125 mM to the media and incubate with shaking for 5 min at RT.1.3. Rinse cells 2 x with 10 ml cold PBS.1.4. Scrape cells into 5 ml cold PBS and transfer into 50 ml tube.1.5. Add 3ml PBS to dishes and transfer the remainder of the cells to the 50 ml tube.1.6. Centrifuge for 5 min at 1,000 g.1.7. Carefully aspirate off supernatant and resuspend pellet in FA Lysis Buffer (750 l per 1107 cells).* When using suspension cells，start with 1107- 5107 cells and treat with both 0.75% formaldehydeand glycine as described above. Pellet cells by centrifugation (5 mins at 1,000 g). Wash 3 x withcold PBS and resuspend pellet in FA Lysis Buffer (750 l per 1107 cells). Proceed to Step 2.1.2. Sonication2.1. Sonicate lysate to shear DNA to an average fragment size of 500 to 1000 bp. This will need optimizing as different cell lines require different sonication times. Follow the fragment size on a 1.5% agarose gel.2.2. Centrifuge for 30 secs，4C，8,000 g and transfer supernatant to new tube.*2.3. Remove 50 l of each sonicated sample This sample is the INPUT，and this is used for obtaining the DNA concentration (see Step 5).*The lysed cells can be snap frozen in liquid nitrogen after and stored at -70C for up to 2 months.Avoid multiple freeze-thawing.3. Immunoprecipitation3.1. Use approximately 25 g of protein per IP. Protein concentration can be calculated using the Bradford assay. Dilute each sample 1:10 with RIPA Buffer. You will need one sample for the specific antibody，and one sample for the beads only control.3.2. Add the primary antibody to all samples except the beads-only control. The amount of antibody to be added has to be determined empirically，1-10 g of antibody per 25 g of protein often works well.3.3. Add 20 l of protein A/G beads (pre-absorbed with sonicated single stranded herring sperm DNA at 1.5 g / 20 l beads*) to all samples and IP overnight with rotation at 4C.3.4. Centrifuge the protein A/G beads for 1min at 2,000g and remove the supernatant.3.5. Wash beads 3 x with 1ml Wash Buffer (centrifuge as above).3.6. Wash beads 1 x with 1ml Final Wash Buffer (centrifuge as above).*Preparation of protein A/G beads with single stranded herring sperm DNA- Mix an equal volume of Protein A and Protein G beads and wash 3 X in RIPA Buffer.- Aspirate RIPA Buffer and add single stranded herring sperm DNA to 75 ng/l beads and BSA to a final concentration of 0.1 g/l beads. Add RIPA Buffer to twice the bead volume and incubate for 30min with rotation at 4C.- Wash once with RIPA Buffer and add RIPA Buffer to twice the bead volume.4. Elution and reverse cross-link4.1. Elute DNA by adding 120l of Elution Buffer to the protein A/G beads and rotate for 15 min at 30C.4.2. Spin down and transfer the supernatant into fresh tube.*4.3. The INPUTs can be included at this stage. Add 80I of elution buffer (when using the DNA purification kit) or 400 l TBS (when using phenol:chloroform) to each INPUT sample. Add either 2 l RNase A (0.5 mg/ml) when purifying DNA using PCR purification kit or 5 l of proteinase K (20 mg/ml) when purifying DNA using Phenol:Chlorophorm to the eluates (INPUTs and IP material) and heat at 65C for 4-5hrs (or overnight).*4.4a.The DNA is then purified using a PCR purification kit following the manufacturers instructions.4.4b. Alternatively the DNA can be Phenol:Chlorophorm extracted and ethanol precipitated in presence of 10l glycogen (5 mg/ml) and taken up in 100 l H2O.4.5. Store samples at -20C or proceed with detection method (PCR，microarray，etc).*4.6. PCR is used to quantify DNA levels of specific loci. This is analyzed semi-quantitatively (analyses of PCR endproduct by agarose gel) using primers which can be designed using the URL below. Alternatively，DNA levels are quantitatively measured by real-time PCR. Primers and probes are often designedusing software provided with the real-time PCR apparatus.* The samples can be frozen and stored at -20C after these steps.* The INPUT DNA is purified as described and the concentration should be calculated. Transfer 5 l of the purified DNA in a tube containing 995 l TE to give a 200-fold dilution and read the OD260. The concentration of DNA in g/ml is OD260 x 10,000. This is used to calculate how much input DNA was included in the immunoprecipitation，and the sample values altered accordingly.SolutionsFA Lysis Buffer50 mM HEPES-KOH pH7.5140 mM NaCl1 mM EDTA pH81% Triton X-1000.1% Sodium Deoxycholate0.1% SDSProtease Inhibitors (add fresh each time)RIPA Buffer50 mM Tris-HCl pH8150 mM NaCl2 mM EDTA pH81% NP-400.5% Sodium Deoxycholate0.1% SDSProtease Inhibitors (add fresh each time)Wash Buffer0.1% SDS1% Triton X-1002 mM EDTA pH8150 mM NaCl20 mM Tris-HCl pH8Final Wash Buffer0.1% SDS1% Triton X-1002 mM EDTA pH8500 mM NaCl20 mM Tris-HCl pH8Elution Buffer1% SDS100mM NaHCO3Proteinase KDissolve in H2O at 20 mg/ml，store at -20C.2.