狂犬病病毒感染改变小鼠To...样受体及相关细胞因子的表达_衣惠鑫.pdf

吉林农业大学学报 2023，45（1）：121-126http:/Email:jlndxb Journal of Jilin Agricultural University狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达*衣惠鑫1，2，张健2，张岩2，霍明赫2，冯烨2，涂长春1，2，刘艳2*1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病防控重点实验室，长春 130122摘 要：Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为重要的固有免疫相关受体，在不同毒力狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染的鼠脑中发生了怎样的变化，目前尚未见具体的报道。因此使用不同RABV毒株（固定毒株CVS-11、街毒株GDMM、弱毒株SRV9）经颅内接种构建小鼠感染模型，并利用RT-qPCR、Western blot等方法探究小鼠脑内 TLRs（TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9）、下游效应分子（IRF3、Irgm1）及相关细胞因子（IL-1、IFN-、IFN-和IFN-）的表达改变。结果显示：CVS-11组与GDMM组相关指标的改变相类似，鼠脑内病毒拷贝数随感染时间的增加而升高，TLR2、TLR8、TLR9、Irgm1及IFN-、表达显著上调，小鼠分别在感染后7，12 d（中位数）死亡；SRV9组的病毒拷贝数在感染后期显著下降，TLR7、TLR8、TLR9和IFN-的变化与病毒拷贝变化趋势一致，IFN-无变化，小鼠未发生死亡。说明 TLR2、TLR7、TLR8、TLR9参与RABV感染后的免疫调控，其中，TLR7的抗病毒作用更为重要，但其具体发挥的作用及作用机制，还有待于进一步研究。关键词：狂犬病病毒；小鼠感染模型；固有免疫受体；Toll样受体；免疫应答中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）01-0121-06DOI：10.13327/j.jjlau.2020.1024引用格式：衣惠鑫，张健，张岩，等.狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达 J.吉林农业大学学报，2023，45（1）：121-126.Expression of Toll-like Receptors and Related Cytokines in Rabies Virus Infected Mice*YI Huixin1，2，ZHANG Jian2，ZHANG Yan2，HUO Minghe2，FENG Ye2，TU Changchun1，2，LIU Yan2*1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control，Military Veterinary Institute/Academy of Military Medical Sciences，Academy of Military Sciences，Changchun 130122，ChinaAbstract：Toll-like receptor(TLRs)is an important innate immune receptor.So far,no specific report has been found on the changes of TLRs in the brains of mice infected with rabies virus(RABV)of different virulence.In this study,we used three RABV strains(fixed strain CVS-11,street strain GDMM and attenuated strain SRV9)to construct infected mouse models via intracranial injection,then RT-*基金项目：国家自然科学基金项目（31972720）作者简介：衣惠鑫，女，在读硕士，研究方向：分子病毒学。收稿日期：2021-01-12*通信作者：刘艳，E-mail：吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，FebruaryqPCR and WB were performed to examine the alteration of TLRs(TLR2,TLR3,TLR4,TLR7,TLR8 and TLR9),downstream effector molecules(IRF3,Irgm1),as well as TLRs related cytokines(IL-1,IFN-,IFN-and IFN-)in mouse brains.The results demonstrated that TLR2,TLR8,TLR9,Irgm1 and IFN-,were significantly up-regulated in CVS-11 and GDMM infected group,accompanied with the increasing viral copies from 3 d to 5 d,and the mouse died at 7 dpi.and 12 dpi.,respectively.Whereas,the viral copies of SRV9 began to decrease at late stage,meanwhile,the alteration of TLR7,TLR8 and TLR9 were similar to that of viral copies,and this strain was not lethal to mice.These results indicated that TLR2,TLR7,TLR8 and TLR9 are involved in RABV induced immune response,among which the antiviral effect of TLR7 is more important,however,its specific role and mechanism need to be further studied.Key words：rabies virus；mouse infection model；innate immune receptor；Toll-like receptor（TLRs）；immune response狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）是典型的嗜神经性病毒，病毒粒子呈子弹状，是有囊膜不分节段的单股负链RNA病毒，可经中枢神经系统逆行侵入宿主大脑，引起温血动物的脑脊髓炎，一旦发病，病死率高达100%。目前，尚无有效治疗方法，暴露前或暴露后接种狂犬疫苗是唯一有效的预防手段。固有免疫是机体产生免疫反应、防御病原微生物的第一道防线。固有免疫细胞通过表达特定的 模 式 识 别 受 体（Patern recognition receptors，PRRs）识别特定病原体，引发炎症反应进而有效清除病原。PRRs 主要包括两大类：Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）和 RIG-样 受 体（RIG-like receptors，RLRs）1。TLRs 属型跨膜受体，通过募集中性粒细胞和吞噬细胞，释放炎症因子（如白介素等）来清除病原。TLRs在人和小鼠中分别包括10个和13个家族受体，根据识别病原体相关的分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的性质及配体类型分成两类，一类主要分布于细胞膜上，包括：TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR11，识别脂质和微生物的膜成分；另一类包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，定位于内质网和核内体，识别核酸2。通常情况下，TLR3识别双链 RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）病毒基因组或单链 RNA 病毒复制过程所产生的dsRNA3。TLR4、TLR7和TLR8可识 别 埃 博 拉 病 毒 等 多 种 病 毒 产 生 的 单 链RNA4-5，TLR9则能直接识别EBV、HPV等游离在细胞浆内的DNA病毒核酸6-7，TLR2可以参与流感病毒的免疫识别8。但RABV感染小鼠后，鼠脑内TLRs及相关细胞因子的改变尚未见详细的报道。本研究通过多种方法验证TLRs及相关细胞因子在不同毒力 RABV 感染小鼠后的表达变化，为阐明不同毒株感染小鼠后TLRs介导的免疫应答，以及不同毒株的致病机制提供一定的研究基础。1材料与方法1.1细胞株与病毒BHK-21（仓鼠肾细胞）、RABV 固定毒株CVS-11、街毒株GDMM（分离自2016年广东茂名伤人犬）、弱毒株SRV9，均由吉林省人兽共患病防控重点实验室保存。1.2试验动物SPF级昆明雌性青年鼠（体质量122 g）购自辽宁长生生物技术股份有限公司。1.3主要试剂与耗材胎牛血清（FBS）和 MEM 细胞培养液购自Corning（美国）公司；青链霉素混合液（双抗）购自Hyclone（美国）公司；0.25%Trypsin-EDTA 购自Gibco（美国）公司；FITC标记抗RABV核蛋白单克隆抗体购自FUJIREBIO（美国）公司；PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）、TB Green Fast RT-qPCR Mix 购自 TaKaRa（中国大连）公司；TRIzol购自Thermo Fisher（美国）；RIPA Lysis Buffer购自Millipore（美国）公司；TLRs抗体购自CST（美国）公司。1.4RABV毒株滴度测定将 RABV 固定毒株 CVS-11、街毒株 GDMM和弱毒株 SRV9等 3种毒株分别接种 BHK-21细122衣惠鑫，等：狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University胞，来测定病毒滴度，病毒滴度测定参照吉林省人兽共患病防控重点实验室之前建立的方法进行9。1.5RABV毒株感染鼠脑的制备将小鼠随机分为CVS-11、GDMM与SRV9攻毒试验组和对照组，每组6只。乙醚麻醉后，按照1107 TCID50/mL 进行颅内注射细胞毒 30 L，对照组注射同体积无血清MEM培养液。每日观察小鼠体质量及临床症状，分别收集对照组（ck）、CVS-11组和GDMM组第3天和第5天（CVS-3d、CVS-5d、GDMM-3d、GDMM-5d）、SRV9 组第 5 天和第9天的脑组织（SRV9-5d、SRV9-9d），称重后根据脑组织重量加适量PBS制备30%匀浆，离心取上清备用。1.6总RNA的提取及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）取100 L鼠脑研磨上清，用TRIzol法提取总RNA，反转录获得cDNA，RT-qPCR进行绝对荧光定量与相对荧光定量分析，引物序列见表1。反应条件：95 30 s；95 5 s，60 30 s 共 40 次循环。1.7Western blot分析取上述鼠脑组织，每个样品加入 200 L 1RIPA于冰上裂解30 min，1.2万 g离心15 min，吸取上清。Bradford法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸处理10 min，每孔上样40 g进行蛋白电泳，转印至NC膜后进行Western blot分析。1.8鼠脑组织样品的直接免疫荧光试验（DFA）取上述鼠脑组织制成抹片，室温下完全干燥，预冷丙酮固定1 h，每张抹片20 L抗体，37 孵育1 h，PBST短暂清洗后显微镜下观察荧光。1.9试验数据处理分析试验数据均为平均值标准差，每组样品为3 只鼠脑 cDNA，每个试验均重复 3次以上，且每个样本每次3个复孔。经GraphPad Prism 9.0软件统计处理分析及图像制作，采用平均值和T检验判断两组数据之间的差异性（“*”表示P0.05，差异显著；“*”表示P0.01，差异极显著）。2结果与分析2.1RABV毒株滴度测定为保证攻毒病毒量均达到3105 TCID50/mL，将毒株分别接种BHK-21细胞来测定病毒滴度。结果显示培养72 h后CVS-11、GDMM和SRV9的滴度分别为107.4，107.33，107TCID50/mL（图1）。2.2不同毒株在鼠脑内的增殖复制情况CVS-11组小鼠体质量持续下降，出现明显精神异常，晚期后肢伸展、拖行现象等明显的临床发病症状，GDMM组小鼠第46天出现明显的狂躁症状，SRV9组小鼠于第4天开始出现精神沉郁，体质量下降，随后开始慢慢好转。使用RT-qPCR、Western blot和DFA方法检测不同毒株在鼠脑内增殖情况，每株毒株分别以5个梯度稀释的标准质粒为参照，样品重复3次进行绝对荧光定量，以3次重复测定结果的平均值作为病毒基因组RNA拷贝数。结果显示：感染后 35 d，CVS-11 与表1引物序列Table 1Primer sequence引物名称RABV-NFRABV-NRIrgm1-FIrgm1-RIRF3-FIRF3-RIFN-FIFN-RIFN-FIFN-RIFN-FIFN-RIL-1 FIL-1 R-actin F-actin R引物序列（53）TGATGAAYGGAGGTCGACTATGAGTTTGGACGGGCTTGATGCTCCACTACTCCCCAACATGCTCCTACTGACCTCAGGTAACGGAAAGAAGTGTTGCGGTTAGTTGCCATTGGTGTCAGGAGGATGGTCCTGGCGGTGCTGATCCTGCGGGAATCCAAAGTCCCAGCAGGTGTATCCTCCAAACTAGACGCTGAACTCCTTCGCTTTCAGCAACAACATAAGCGTCATCCTCAAACTTGGCAATACTCCCTCTGATGGGCAACCACTTTTCATCCCCCACACGTTGACCGATGAAGATCAAGATCATTGAAGCATTTGCGGTGGAC图1不同RABV毒株病毒滴度Fig.1TCID50 of different RABV strains123吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，FebruaryGDMM组小鼠病毒拷贝数显著增加（P0.05）；感染后 59 d，SRV9 拷贝数发生减少（P0.05），SRV9组拷贝数于第5天达到每微升9.21011，第9天降至每微升1.11010（图2）。Western blot 和 DFA 试验检测鼠脑中病毒 P蛋白及N蛋白的表达。由图3和图4可见：蛋白和mRNA水平变化趋势一致，GDMM和CVS-11的P蛋白随时间的增加表达量上调，第5天荧光显著；而SRV9的P蛋白表达显著低于CVS-11与GDMM，且随着时间的增加而减少，第59天荧光进一步减弱。由此可见，CVS-11和 GDMM 的增殖能力显著高于SRV9。2.3RABV感染鼠脑中不同TLRs的表达情况RT-qPCR 检测感染 RABV 不同毒株后鼠脑中TLRs的变化。结果显示：与对照组相比，CVS-11 与 GDMM 感 染 鼠 脑 中 TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9的表达均上调；其中，TLR3、TLR4、TLR7与TLR2、TLR8、TLR9相比，变化倍数相对较小；而在SRV9感染鼠脑中，TLRs的变化趋势与病毒增殖趋势相同，TLR3基本无变化，在感染第5天，TLR4上调5.22倍，TLR2、TLR7、TLR8、TLR9上调极为显著，其中TLR8最高可达157.74倍，第9天TLRs表达均下降（表2，图5）。以上结果提示，多种TLRs可能参与RABV的抗病毒感染，其中，TLR7的作用可能更为有效，但在CVS-11毒株与GDMM毒株感染早期激活被抑制；TLR8、TLR9可能参与早期病毒的清除，但感染晚期可能主要参与引起炎症反应和组织损伤。图2RT-qPCR检测RABV等3种毒株在鼠脑中不同时间的基因组拷贝数Fig.2RT-qPCR detection of the copy number of RABV in mouse brains at different time1.ck;2.SRV9-5d;3.SRV9-9d;4.CVS-3d;5.CVS-5d;6.GDMM-3d;7.GDMM-5d图3Western blot检测不同毒株P蛋白在鼠脑中的表达Fig.3Western blot detection of P protein expression in mouse brains注：红色荧光为组织；绿色荧光为病毒图4直接免疫荧光检测RABV在鼠脑中的感染Fig.4Direct immunofluorescence assay detection of RABV infection in mouse brains表2RT-qPCR检测接种不同RABV毒株后TLRs的相对表达量Table 2RT-qPCR detection of TLRs in mouse brains infected by different RABV strains处理阴性对照组SRV9-5dSRV9-9dCVS-3dCVS-5dGDMM-3dGDMM-5dTLR2128.7*9.0111.0246.94*22.36*27.82*TLR312.271.403.48*5.86*2.56*4.03*TLR415.22*1.583.00*5.69*2.455.31*TLR7124.77*5.396.73*7.54*8.11*11.31*TLR81157.74*9.719.1847.17*17.26137.28*TLR9132.00*9.014.1734.94*11.83*25.94*注：与阴性对照相比，“*”表示感染后变化显著，“*”表示感染后变化极显著。下表同124衣惠鑫，等：狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University2.4RABV感染鼠脑中细胞因子的表达情况TLRs 激活后通过调控下游多种效应分子和细胞因子来调控机体的抗病毒反应，结果见表 3。与对照组相比，IRF3 和 IFN-变化上调，IFN-在 CVS-11 与 GDMM 组上调约 10 倍，IL-1 变化显著，在 GDMM 感染后，表达持续上调；CVS-11 组 IL-1 的变化相对不显著；而在弱毒感染后，先上调至和 GDMM 同期水平，随后迅速下降至接近初始的水平，避免诱导炎症 反 应 的 发 生；IFN-能 够 诱 导 免 疫 相 关IRgm1 的表达，与对照组相比，弱毒感染早期IFN-显著上调，随后下降，而在 CVS-11 和GDMM 感染组中均在感染晚期才显著上调，提示 IFN-在早期病毒清除中的作用可能更为显著和有效。3讨论本研究通过多种方法证实了3种RABV在鼠脑内增殖能力显著不同，弱毒 SRV9增殖能力显著低于固定毒株CVS-11与街毒株GDMM。CVS-11与GDMM在鼠脑内从病程初期到晚期拷贝数一直升高，而 SRV9 第 5 天基因组拷贝数是以上2 种毒株的1/3，随后迅速减少。由于TLRs是病毒感染的重要免疫防御受体，提示其可能在抗RABV反应中发挥重要的作用。在RABV感染后不同时间的结果显示，不同毒株CVS-11、GDMM和SRV9均可以引起多种TLRs的变化，其中与对照组相比，TLR3变化不显著，而TLR7在弱毒感染后激活显著。SRV9组中TLR7在第5天上调的倍数显著高于CVS-11与GDMM组，提示TLR7可能参与了病毒清除。有研究显示，TLR8 可以参与HCV等RNA病毒的清除10。本研究结果显示，与对照组相比，TLR8在不同毒株感染的第5天均显著上调，在 CVS-11 感染鼠脑中上调约 50 倍，在GDMM和SRV9中TLR8上调约150倍，表明TLR8有可能通过引发炎性反应发挥抗病毒的作用，但在感染早期有效，在发病后期，随着病毒量剧增，不能有效清除病毒，而剧烈的炎症反应会加剧小鼠的脑脊髓炎和组织损伤。另据报道，TLR9作为识别细菌或病毒 DNA 的受体6，也可能参与了RABV的免疫识别，具体机制尚不清楚。IRF3是病毒诱导型干扰素（IFN-）表达通路中关键的转录因子11，但其在RABV感染后无显著变化，并且与对照组相比，IFN-感染前后基本无变化，IFN-在GDMM和CVS-11感染后上调约10倍，但在弱毒中无显著变化，提示IFN-图5Western blot检测小鼠接种不同RABV毒株后TLRs的变化Fig.5Western blot detection of TLRs in mouse brains infected by different RABV strains表3RT-qPCR检测小鼠接种不同RABV毒株后相关细胞因子的相对表达量Table 3RT-qPCR detection of the changes of the related cytokines in mouse brains infected by different RABV strains处理阴性对照组SRV9-5dSRV9-9dCVS-3dCVS-5dGDMM-3dGDMM-5dIRF310.891.281.81*2.10*0.640.84IRgm11110.44*23.1296.07*269.80*109.28*230.36*IFN-11.722.299.37*12.33*6.61*8.85*IFN-10.630.722.12*0.701.82*0.55*IFN-1168.72*23.7415.62187.53*26.33*144.22*IL-11231.23*33.8971.3673.60226.03*263.33*125吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，February未能有效参与RABV的抗病毒反应；TLR9可以诱导型干扰素IFN-的生成12，IFN-在CVS-11与GDMM感染初期（3 dpi）无显著增加，而在感染第5天，随着病毒感染时间的增加，其mRNA水平显著上调，但由于已经是病程晚期，不能有效清除病毒，然而对于弱毒来说，在病毒到达峰值时，IFN-也到达峰值，可能有效抑制病毒。另外，TLR7可识别病毒 RNA，并通过 MyD88依赖途径诱导IL-1的表达13。本研究结果显示，与对照组相比，TLR7在弱毒SRV9感染中上调显著，并且与IL-1的变化趋势一致，CVS-11与GDMM感染后IL-1也持续显著上调，但TLR7变化倍数相对较小，提示 TLR7-IL-1b 通路可能还受到某些重要细胞因子的调控，而固定毒株 CVS-11与街毒株 GDMM 中 TLR7-IL-1b 通路被抑制，进而阻断TLR7对IL-1的调控，而在弱毒SRV9中，该通路可以有效发挥抗病毒作用并有效减缓感染后期炎症反应。本研究对Toll样受体家族在不同毒力RABV感染后的表达变化及相关细胞因子的变化进行了探讨和阐述，但TLRs抗RABV的具体作用机制还有待于后续基于细胞和基因敲除动物水平的深入研究。参考文献：1 Thompson A J V，Locarnini S A.Toll-like receptors，RIG-I-like RNA helicases and the antiviral innate immune responseJ.Immunology 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