转抗虫基因107杨对根际和内源细菌群落的影响.pdf
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1、/转抗虫基因 杨对根际和内源细菌群落的影响路文然 任亚超 赵津 王进茂 郭甫鑫 张军(河北农业大学 林学院 河北 保定 河北省林木种质资源与森林保护重点实验室 河北 保定)摘要:为研究转抗虫基因对根际和内源细菌群落的影响 以转抗虫基因 杨田间对比试验林为对象 采用高通量测序技术对转基因株系和对照株系根际土壤细菌、树干韧皮部和根系内生细菌群落结构组成及多样性进行对比分析 结果显示:()土壤样品中有效序列平均在 以上 杨树组织有效序列平均在 以上()转基因株系细菌物种组成与对照株系的极其相似 酸杆菌门与变形菌门为转基因和非转基因株系根际土壤的优势菌门 占比分别为 和 蓝藻菌门和变形菌门为转基因和非
2、转基因株系韧皮部的优势菌门 所占的比率分别为 和 变形菌门为转基因和非转基因株系根部的优势菌门 所占的比率分别为 和 ()转基因和非转基因株系在细菌群落的丰富度和多样性上均没有表现出明显的差异 但不同部位之间差异显著 结果表明:转基因 杨没有对根际土壤和内生细菌造成显著影响 明确了转抗虫基因 杨不同部位细菌群落特征 为转抗虫基因 杨的生物安全评价提供了有益的参考关键词:转抗虫基因 杨 高通量测序 细菌群落 丰富度 多样性中图分类号:文献标识码:文章编号:()():第 卷 期 年 月 西 部 林 业 科 学 收稿日期:基金项目:农业生物育种重大项目()国家林业和草原局科技发展中心项目()河北农业
3、大学引进人才科研专项()第一作者简介:路文然()女 硕士研究生 主要从事林木遗传育种研究:通信作者简介:张军()男 博士 副教授 主要从事林木遗传育种研究:转基因林木种植后对土壤微生物的影响是全面系统研究转基因林木对森林生态系统服务功能不可或缺的内容 等认为在植物体内复杂的微生物群落中 存在着一些相互作用的菌群 这些菌群之间紧密联系 协同参与多种重要的代谢过程 因此 通过分析内生菌相对丰度上的相关性能够了解微生物之间复杂的互作关系 有利于发掘潜在的功能菌群 可更有效地在农业生产中利用微生物资源 综合国内外的研究现状 转基因植物是否会对土壤微生物造成影响尚无定论 金凌波等研究表明 磷高效转基因大
4、豆()的种植不会对根际土壤可培养微生物产生明显影响 在巴西种植的转 抗虫基因玉米()与非转基因玉米相比 氨氧化细菌和古细菌群落的丰富度差异明显 不过研究表明土壤微生物群落结构主要受土壤类型和季节的影响 而受植物基因型的影响较小 等也认为作物生育期、土壤理化性质和土壤类型等是影响根际微生物结构的主要因素 在转基因杨树()方面 李霞等对转 基因欧洲黑杨()、张雁等对转 基因南林 杨、马晓星等对转 基因杨树、吕秀华等的研究结果中 均未发现转基因杨树对土壤微生物有负面影响杨树不仅具有生长速度快、轮伐期短、生命力强、用途广泛等特点 还具有净化空气、涵养水源、保持水土、防风固沙等生态作用 杨树已成为解决我
5、国木材供应的重要用材树种 为国家经济建设提供了大量木材 发挥了巨大的经济效益、生态效益和社会效益 土壤被称为世界上最重要的能源之一 土壤生态系统与功能直接关系到整个生态系统健康 在转基因植物的生长周期中 外源基因表达产物主要通过植株残体和根系分泌物进入土壤 根系生长与土壤接触伴随整个转基因植物生长周期 美国()将转基因植物对土壤生态系统影响列为风险评价的重要组成部分 因此 转基因产品释放的生态风险之一就是对土壤生态系统影响的评估 此外植物内生菌与其宿主在长期进化过程中形成一种共生或互生的关系 对植物的生长发育、病虫害防治、植物抗性、生物修复等方面都有积极的作用能显著提高植物的产量和高度 大量研
6、究表明植物内生菌在植物生长发育过程起重要作用杨树不同生态位内生菌菌群组成和形成机制尚不清楚 基因转化可能导致受体植物自身一些代谢物的非预期变异而影响体内环境 进而影响植物内生微生物定植 在微生物群落的研究方法中 高通量测序技术克服了平板培养、变性梯度凝胶电泳技术等方法的不足 测序速度快、覆盖度高 能够全面解析复杂的微生物群落 相对分子量大小适中 突变率小 基于 的高通量测序技术已被广泛应用于微生物系统进化、分类及多样性研究中 杨是由中国林科院张绮纹研究员等从我国 年引自意大利的“美洲黑杨 欧洲黑杨”()无性系中选育而成 其材性良好 干型优美 树冠窄 侧枝细 叶满冠 抗病虫 抗风折 是重要的林业
7、资源 在林业生产中具有重要的地位 本研究利用 测序技术 对 生未转基因 杨、转 和 基因 杨高抗株系 和 树干韧皮部、根系及根际土壤进行 区测序 解析 杨根际土壤、根部、韧皮部细菌群组成与结构差异 获得全面的微生物信息 探讨转基因杨树对根际土壤及内源细菌群落可能造成的影响 以期为转基因林木产业化的自然生态风险评估提供参考 材料与方法 样品采集于 年 月进行样品的采集 选定 个转基因株系、和对照株系()为样本 每个小区选定 株 次重复 同时在树高 处采集树干韧皮部样品 用灭菌手术刀轻轻刮开树皮表面 切取厚 大小的韧皮部装入 第 期 路文然等:转抗虫基因 杨对根际和内源细菌群落的影响无菌塑封袋中
8、置 冰箱中保存备用 于采集韧皮部的同一株系 沿树基部从东、西、南、北 个方向挖掘深度约 防止挖断主根 待根系暴露后用无菌剪刀剪取须根 将根系周围大块土壤轻轻抖落后将根系及根系附带土壤装入无菌密封袋中 所有采集好的样品置于干冰环境中带回实验室备用 样品信息见表 表 样品及编号.样品来源编号根部韧皮部根际土 样品处理根际土样品:使用灭菌的细软毛刷 轻轻刷掉根系表面的土壤 去除土壤表面毛根并通过 灭菌滤筛 将过筛后的土壤置于 试管中 根系样品:用无菌水清洗根系表面土 次 将洗净的根系放于 中 使用超声波在 超声 重复 次 用无菌吸水纸吸干根系表面水分后 用无菌手术刀将样品分成 片段装入无菌塑封袋 韧
9、皮部样品:根据研究选取 新鲜植物组织 用无菌水冲洗 遍 后置于无菌塑封袋中 采集韧皮部样品组织放于 离心管中并置于液氮中保存 干冰条件运输 以上所有处理好的样品置于 保存 测序 为原核生物的核糖体特征编码序列常用于细菌以及古细菌的物种分类以及进化关系研究 从样本中提取基因组 后 用带有 的特异引物扩增 的保守区 引物序列信息见表 表 引物序列信息.类型测序区域引物名称引物序列产物长度/细菌 细菌 细菌 细菌 古菌 对 扩增产物切胶回收 采用 荧光计进行定量 将纯化的扩增产物进行等量混 合 与 测 序 接 头 连 接 构 建 测 序 文 库 上机测序 通过测序得到 之后 过滤低质量 然后进行组装
10、和过滤 以保证利用最有效数据聚类 依次进行物种注释、多样性分析、多样性分析 在有效分组的情况下进行组间差异比较及差异检验 结果与分析 聚类分析及稀释性曲线聚类分析及稀释曲线又称 即分类操作单元 根据不同的相似度水平 对所有序列进行 划分 通常来说 如果有效序列大于 即定义为一个 每个 对应一种代表序列使用()软件中的 对序列()在 的相似度水平下进行类聚、获得 并基于细菌和真菌分类学数据库对 进行分类学注释 方差分析结果显示(图)不同部位之间转基因、株系与对照株系之间有显著差异 相同部位之间只有转基因 株系与对照株系之间有显著差异稀释性曲线是利用已测得序列中已知的 的相对比例 来计算抽取 个(
11、小于测得 序列总数)时的 多样性指数期望值 然后根据西 部 林 业 科 学 年一组 值与其相对应的 多样性指数期望值做出曲线 稀释性曲线用于评估序列数量是否足以覆盖所有类群 并间接反映样品中物种的丰富程度 当曲线趋向平坦时 说明测序数量渐进合理 反之则需要增加测序数据 如图 所示:每条曲线代表一个样品 用不同颜色标记 个样品的稀释性曲线随着测序量的增加 所能得到的稀释性曲线逐渐趋于饱和 表明取样基本合理图 转基因 杨与对照杨的 数量柱状图 图 转基因 杨与对照杨微生物群落多样性的稀释性曲线 物种注释及相对丰度根据不同层级分类水平上不同样品的物种组成情况 用堆叠图的形式 直观展示不同样品在各个分
12、类层级水平上的物种丰度的变化情况 无法注释到该水平的 则被归类到 类别 由图 可知 各样品的优势细菌群落相同 主要分布于以下 个门:变形菌门()、蓝藻菌门()、酸杆菌门()、拟杆菌门()、放线菌门()、泉古菌门()、绿弯菌门()、浮霉菌门()、髌骨细菌门()和疣微菌门()个门类细菌在所有细菌中所占百分比达 其中变形菌门为根部样品中的优势菌门 占比 第 期 路文然等:转抗虫基因 杨对根际和内源细菌群落的影响 酸杆菌门和变形菌门为根际土壤样品中的优势菌门 占比 蓝藻菌门和变形菌门为韧皮部样品中的优势菌门 占 整 体 上 看 转 基 因 株 系、菌类组成与对照株系 极其相似 但各类细菌的数量存在差异
13、 对照的根部变形菌门细菌数量高于转基因株系 对照和转基因株系蓝藻细菌数量无明显差异 转基因株系根部放线菌门细菌数量高于对照株系 转基因株系根际土各类细菌数量与对照基本无差异图 微生物物种组成及分布(门水平)()微生物数目或种类发生变化 通常会导致样本性质发生改变 为了观测不同环境中物种的变化情况 可以对物种在不同环境下的丰度进行聚类分析 物种丰度作为观测微生物指标的重要变量 可以通过绘制微生物物种丰度聚类热图来观察不同样本的分布情况 对 株系和转基因 和 株系的不同样品物种丰度的聚类分析(图)可以看出 个样品中物种丰度较高的细菌有 个门不同株系的根际土样本形成一个分支 韧皮内微生物和根内微生物
14、形成一个分支 但是根内微生物又独立形成一个分支 表明大部分根内微生物、韧皮内微生物和根际土微生物分别聚类到一起 其中只有 没有与其它韧皮内微生物聚类到一起 而与根内微生物聚在一起 说明除 外 其余不同株系的相同部位微生物物种丰度差异不显著 梭杆菌门()、厚壁菌门()、蓝藻门()、栖热菌门()、拟杆菌门()在韧皮部丰度最高 而放线菌门()在根内丰度最高 其余细菌在根际土内丰度最高 聚类结果表明转基因 杨对微生物物种丰度没有影响图 样品门水平的微生物物种相对丰度 西 部 林 业 科 学 年 扩增子多样性分析 多样性是指微生物在特定生物环境或者生态系统内物种数目的多样性情况 主要利用不同生境内微生物
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