猪源支气管败血波氏杆菌对庆大霉素异质性耐药的研究.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45,No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302014猪源支气管败血波氏杆菌对庆大霉素异质性耐药的研究樊浩然1,高树基1,王海堃1,袁朔1,张小玲1,赵战勤1,张慧2*,汪洋1*(1.河南科技大学 动物科技学院/河南省畜禽新发传染病检测与防控工程研究中心,河南 洛阳 471000;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东 青岛 266032)摘要:为分析临床分离的52株猪源支气管败血
2、波氏杆菌(Bb)在纸片扩散法(K-B)药敏试验中出现的庆大霉素(GEN)异质性耐药(HR)情况,本研究采用微量肉汤稀释法检测52株Bb分离株对GEN的最小抑菌浓度(MIC);采用K-B法检测分离株对GEN的敏感性;通过观察抑菌环内是否有菌落初步筛选疑似GEN HR菌株;采用菌落谱性分析法(PAP)测定初筛菌株的MIC与最大不抑菌浓度(MNIC)的比值,以及耐药亚群菌株的发生频率,验证初筛的HR菌株。结果显示:52株猪源Bb对GEN耐药的菌株占13.46%(7/52),多数分离株的MIC值为2 滋g/mL8 滋g/mL,对GEN表现为敏感或中介,占全部菌株的86.54%(45/52),其中Bb4
3、8株的MIC为2 滋g/mL,抑菌环直径为16 mm属于GEN敏感菌株。通过观察纸片法药敏试验中的抑菌环内是否存在菌落,初步筛选对GEN HR的菌株。结果显示,有7株疑似HR菌株;PAP试验结果显示,6株疑似HR菌株的MIC/MNIC比值均小于8,为假阳性HR菌株,只有Bb48株的MIC/MNIC值为16且耐药亚群发生频率为1.3伊10-6,按照标准判定其为GEN HR Bb菌株。从PAP 试验验证的Bb48株中有菌落生长的最高浓度GEN平板上随机挑3株耐药亚群菌株,37 培养12 h,每小时测一次菌落数,共测12 h连同Bb48株一起绘制生长曲线;将上述试验选取的3株耐药亚群菌株连续传50代
4、,每5代测其MIC值判定耐药亚群菌株的耐药遗传稳定性。生长曲线结果显示Bb48株及其耐药亚群菌株的生长速率均无显著差异(0.05);耐药遗传稳定性试验结果显示,将Bb48株中的3株耐药亚群菌株传代,其中两株菌各代次的MIC均为32 滋g/mL,1株菌的MIC为8 滋g/mL32 滋g/mL。表明耐药亚群菌株对GEN的耐药性能够有效遗传。上述结果表明,52株猪源Bb中的Bb48为GEN HR菌株,Bb48及其耐药亚群菌株的生长速率基本一致,且对GEN的耐药性能够稳定遗传。本研究首次得到了罕见的对GEN HR的Bb菌株,提示临床中应合理使用GEN,并监测HR菌株的出现,对临床使用GEN治疗猪源Bb
5、感染具有重要指导意义。关键词:支气管败血波氏杆菌;庆大霉素;异质性耐药;临床治疗中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)08-0801-06Heteroresistance to Gentamicin offrom pigsFAN Hao-ran1,GAO Shu-ji1,WANG Hai-kun1,YUAN Shuo1,ZHANG Xiao-ling1,ZHAO Zhan-qin1,ZHANG Hui2*,WANG Yang1*(1.Henan Provincial Engineering Research Center for Detection a
6、nd Prevention and Control of Emerging Infectious Diseases inLivestock and Poultry,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,China;2.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266032,China)收稿日期:2023-02-17基金项目:国家自然科学基金(32172852、31902309
7、);河南省杰出青年科学基金(222300420005)作者简介:樊浩然(1998-),男,河南濮阳人,硕士研究生,主要从事畜禽分子病原学与免疫学研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authorAbstract:To analyze the heteroresistance to Gentamicin(GEN)in clinical isolates of 52 porcine-origin(Bb)strains in antibiotic sensitivity tests by the Kirby-Bauer(K-B),the present study was
8、conducted to measure theminimum inhibitory concentration(MIC)of 52 isolates using the micro-broth dilution method;the K-B was used to detect the GENsusceptibility of the isolates,while the suspected heteroresistant strains were initially screened by observing whether there werecolonies in the inhibi
9、tion ring;the population analysis profiling(PAP)was used to determine whether the MIC/maximunnon-inhibitory concentration(MNIC)values of the primary strains and whether the frequency of antibiotic-resistant subgroups inheteroresistant strains to verify the heteroresistant strains.The results showed
10、that 52 strains ofwere resistant toGEN at 13.46%(7/52),and most isolates had MIC values in the range of 2滋g/mL-8滋g/mL,appearing to be sensitive to GEN orintermediary,accounting for 86.54%(45/52)of all isolates,of which the MIC of Bb48 was 2滋g/mL and the diameter of theinhibitory ring of Bb48 was 16
11、mm,which belonged to the GEN-sensitive strains.Observation and preliminary screening of thepresence of colonies within the inhibition ring in the K-B test showed 7 suspected heteroresistant strains,PAP test showed that theMIC/MNIC ratios of the 6 suspected heteroresistant strains were less than 8,wh
12、ich were false-positive strains,only the MIC/MNICvalue of strain Bb48 was 16 and the frequency of resistant subgroups was 1.3伊10-6,which was determined as GEN heteroresistantstrain ofaccording to the criteria.Three strains of resistant subpopulation were randomly picked from the GENplate with the hi
13、ghest concentration of colony growth in Bb48 strains verified by PAP test,and cultured at 37for 12 hours.Thenumber of colonies was measured every hour,and the growth curve was plotted together with the Bb48 strains for 12 hours.The 3resistant subpopulation strains selected in the above test were con
14、tinuously passaged for 50 generations,and the MIC values weremeasured every 5 generations to determine the genetic stability of the 3 strains in resistant subpopulation.The results of growthcurve analysis showed that the growth rate of antibiotic-resistant subgroup strains in Bb48 was not statistica
15、lly different from that ofparental strains(0.05);the results of antibiotic resistance genetic stability test showed that the MIC of antibiotic-resistantsubgroup strains in Bb48 consistently maintained at about 32滋g/mL after passage,indicating that the antibiotic resistance could beeffectively inheri
16、ted.Combining the above experimental results,among the 52 strains of,Bb48 was verified to bea GEN heteroresistant strain,and the growth rate of the resistant subgroup in Bb48 was basically the same as that of the parentstrain,and the resistance to GEN could be stably inherited.In this study,a rare B
17、b strain with heteroresistance to GEN wasobtained for the first time,suggesting that GEN should be used reasonably in clinical practice and the emergence of heterogeneousresistant strains should be monitored,which has important guiding significance for the clinical use of GEN in the treatment ofporc
18、ine Bb infection.Key words:;gentamicin;heteroresistance;clinical treatment支气管败血波氏杆菌(,Bb)是一种革兰阴性短小球杆菌,依靠黏附素和皮肤毒素等毒力因子引起感染,是导致猪萎缩性鼻炎和许多呼吸道疾病的主要病原,严重危害养殖业的健康发展1。Bb也可以感染人类,人类的感染通常与猪、犬、猫、兔等感染动物的直接接触有关,主要导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者等免疫功能低下或缺陷的人群形成细菌性肺炎或复发性菌血症,引起人们的广泛关注2-3。异质性耐药性(Heteroresistance,HR)是指在单一细菌分离株中同时存
19、在抗生素敏感亚群细菌和抗生素耐药亚群细菌混合的耐药特性,在临床抗生素药物治疗中使用的抗生素浓度一般只能杀死HR菌株中的敏感亚群却不能杀死耐药亚群,导致该类细菌对相应抗生素的敏感性降低3。虽然当前HR菌株的耐药机制尚不清楚,但HR菌株的出现已对临床用药造成极大的影响4-5。庆大霉素(Gentamicin,GEN)是一种氨基糖苷类抗生素,普遍用于治疗Bb等革兰氏阴性菌引起的感染,是兽医临床中治疗呼吸道感染常用的抗菌类药物6。为了探究Bb对GEN的HR现象和相关耐药特征,本研究选取临床分离的52株猪源Bb进行GEN药敏性检测从中筛选出HR菌株,检测HR菌株及其耐药亚群细菌的生长曲线及耐药遗传稳定性,
20、为临床治疗Bb感染提供有效的借鉴和指导。中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年8021材料与方法1.1菌株52株猪源Bb由河南科技大学畜禽分子病原与免疫学重点实验室临床分离并保存;分离株Bb527为GEN耐药Bb菌株。Bb CVCC-2999株为质控菌株,由河南科技大学畜禽分子病原与免疫学重点实验室保存。1.2主要试剂Kirby-Bauer(K-B)GEN药敏纸片、GEN粉剂均购自杭州天和微生物试剂公司;Luria-Bertani(LB)肉汤培养基、琼脂粉均购自北京双旋微生物培养基制品厂。1.3Bb对GEN最小抑菌浓度(Minimum inhibitoryconcentration,MIC
21、)的测定根据参考文献,采用微量肉汤稀释法测定52株Bb对GEN的MIC值7。本研究使用临床和实验室标准研究所抗菌药敏实验标准 文 件(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)M100-ED32:2022中公布的肠杆菌科标准判定结果。当MIC值臆4 滋g/mL时为敏感(Susceptiblity,S),当MIC值逸16 滋g/mL时为耐药(Resistance,R),当MIC值等于8 滋g/mL时为中介(Intermediate,I),质控菌株为BbCVCC-2999株。1.4Bb对GEN的纸片法药敏试验参照CLSI药敏实验标准采用K-B纸
22、片法,测定52株Bb对GEN的敏感性8。判定结果参照CLSI文件M100-ED32:2022,当抑菌环直径逸15 mm时为敏感(S),当抑菌环直径臆12 mm时为耐药(R),当抑菌环直径为13 mm14 mm时为中介(I)。通过肉眼观察抑菌环中是否有大 小 不 一 的 菌 落,初 步 筛 选 疑 似 HR 菌 株。设BbCVCC-2999株为质控菌株。1.5HR菌株的菌落谱性分析(Population analysisprofile,PAP)验证对初筛的疑似HR菌株采用PAP验证,这是目前鉴定HR菌株的黄金标准9。根据MIC结果,分别配制含1 滋g/mL128 滋g/mL(2倍倍比稀释)8个浓
23、度的GEN平板。分别挑取疑似HR菌株单菌落于LB培养基中,37 过夜培养后将菌液10倍倍比稀释(102cfu/mL107cfu/mL)后分别涂布于不同浓度GEN平板上,同时设无抗生素平板为空白对照,每组实验重复3次。37 培养24 h36 h后菌落计数,并以GEN的浓度为横坐标,以平板上的菌落数为纵坐标,利用GraphPad Prism软件绘制PAP曲线图。在曲线图中菌落数首次减少时对应的GEN浓度称为最大不抑菌浓度(MNIC),将GEN浓度最高且有细菌生长的平板统计的菌落数与无抗生素平板上的菌落数相比得到HR菌株中的耐药亚群发生频率,当MNIC/MIC比值大于8,且耐药亚群发生频率大于1伊1
24、0-7,则认为该菌株为HR菌株。同时设BbCVCC-2999株为敏感菌株对照,设分离株Bb527株为耐药菌株对照。1.6HR菌株及其耐药亚群菌株生长曲线的测定测定菌株的生长曲线主要是通过对比HR菌株的亲本菌株与耐药亚群菌株在相同培养条件下的生长速率是否有差异,以判断耐药亚群菌株是否能够正常生长10。从1.5中有菌落生长的最高浓度GEN平板上随机挑3株耐药亚群菌株连同其亲本菌株Bb一起于37 培养12 h,每小时涂板并经菌落计数,每组试验重复3次。根据菌落数绘制4株菌的生长曲线。1.7耐药亚群菌株的耐药遗传稳定性试验耐药遗传稳定性试验是为了检验HR菌株中耐药亚群菌株的耐药性是否能在无抗生素环境下
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