猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展.pdf
《猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、0240-08网络首发时间:2 0 2 3-10-2 62024,54(02):240-247中国兽医科学2 0 2 4,54(0 2)ChineseVeterinarySScience00I:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0019中图分类号:S852.659.6文献标志码:A文章编号:16 7 3-46 96(2 0 2 4)0 2-猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展何松,汤德元*,曾智勇,王彬,黄涛,毛茵茗,周飘,廖正波,陈旭,袁盛林,胡雯雯,周敏(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025)摘要:日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephaliti
2、svirus,JEV)是人兽共患病日本乙型脑炎的病原,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此,建立快速可靠的JEV检测方法,有利于及时检测JEV和采取措施防控日本乙型脑炎。本文总结了近年来检测JEV的新型方法,包括分子生物学检测、免疫学检测、生物传感器检测等技术,以期为有效诊断及防治JEV感染提供技术指导。关键词:猪日本乙型脑炎;日本乙型脑炎病毒;检测Research progress on novel detection methods ofporcine Japanese encephalitis virusHE Song,TANG Deyuan,ZENG Zhiyong,WANG Bin
3、,HUANG Tao,MAO Yinming,ZHOU Piao,LIAO Zhengbo,CHEN Xu,YUAN Shenglin,HU Wenwen,ZHOU Min(College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)Abstract:Japanese encephalitis virus(JEV)is the zoonotic agent of Japanese encephalitis,which had caused hugeeconomic loss to the global pig indust
4、ry.Therefore,the establishment of the rapid and reliable method to detectJEV was conducive to the timely detection of JEV and the prevention and control of Japanese encephalitis.Thisstudy provided a comprehensive overview of the novel detection methodologies for JEV in recent years,includingmolecula
5、r biological detection,immunological detection,biosensor detection to offer technical guidance for effec-tive diagnosis and prevention of JEV infection.Key words:porcine Japanese encephalitis;Japanese encephalitis virus;detection*Corresponding author:TANG Deyuan,E-mail:日本乙型脑炎(Japaneseencephalitis)是一
6、种能通过蚊子传播的由日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)感染动物引起的人兽共患传染病。JEV属于黄病毒科黄病毒属,基因组为单股正链RNA,长约11kb,只有1个开放性阅读框(ORF),共编码3个结构蛋白 C、p r M(M)和E和7 个非结构蛋白(NS1、NS2 A、NS2 B、NS3、NS4A、NS4B和NS5),其主要的传播媒介是三带喙库蚊 。JEV感染人和动物后可引起严重的神经系统病理性症状,对人的致死率可高达30%,即使幸存者,也有近50%的概率出现神经损伤后遗症。规模化养殖的猪数量大,养殖密度高,更容易通过“猪-蚊-猪”的循环模式扩大病毒的传
7、播范围,商品猪感染后大多无明显临床症状,而妊娠母猪的临床表现有高热、流产、死胎和木乃伊胎,公猪则出现睾丸炎 2 ,给世界各国养猪业带来了重大经济损失。因此,尽早快速、准确检测JEV已成收稿日期:2 0 2 3-0 8-11;修回日期:2 0 2 3-10-2 0基金项目:国家自然科学基金项目(318 6 0 7 16);贵州大学重点项目(黔科合平台人才【2 0 18 57 8 1-8)作者简介:何松(1999-),男,贵州铜仁人,硕士生,研究方向为动物传染性病原分子生物学,E-mail:。*通讯作者:汤德元(196 4-),男,教授,博士生导师,主要从事动物传染性病原分子生物学和中西兽医结合诊
8、疗的教学与科研工作,E-mail:t d y u a n 16 3.c o m。241何松等:猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展第2 期为防控和净化日本乙型脑炎的先决条件,本文对JEV当前新型诊断方法进行总结,以期为日本乙型脑炎的检测和防治提供技术支持1分子生物学检测1.1RT-PCR反转录聚合酶链反应(Reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)是常用于检测 JEV的一种方法,与其他传统方法(如病原鉴定)相比具有耗时较少、特异性强和灵敏度高等特点。近年来,由于多重PCR方法能够快速鉴别临床症状及病理变化相似的各种传染病病原,
9、从而得到了广泛的应用。樊欢等 3 将多重RT-PCR技术与核酸侵人反应及纳米金显色技术联用,建立了针对引起脑炎的JEV、东方马脑炎病毒(Easternequineencephalitisvirus,EEEV)、西方马脑炎病毒(Western equine en-cephalitis virus,WEEV)、西尼罗病毒(West nile virus,WNV)和尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)这5种病毒的检测方法,该方法将目标模板转化为信号分子的检测,最后利用纳米金对PCR产物进行显色,从而实现检测结果的可视化;该方法对5种病毒的检测灵敏度均为10 copies/L,具有较高的特异性及灵
10、敏度。由于上述5种病毒的易感动物和传播媒介均相同或者类似,临床症状也大致相同,因此该方法可显著提高虫媒病毒的检测效率,为各国制定防范外来传染病预警措施提供技术支持。涂藤等 4 将多重RT-PCR与毛细管电泳相结合,建立了能高效检测7种常见猪易感病原 JEV、猪瘟病毒(Classical swinefevervirus,CSFV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduc-tive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)
11、、猪链球菌(Strepto-coccus suis)、沙门菌(Salmonella)的方法,电泳时所需样品低于1L,方便后续的核酸回收等试验,对7种病原的检测限为10 3copies/L,对6 3份临床样品检测的结果与国际标准检测方法的检测结果完全一致,表明该方法具有高通量、特异性好、灵敏度高等优点。此外,该方法在鉴别猪易感病原的同时,还能够检测常见的人兽共患病病原,这对实验研究人员和社会公共卫生都具有重大意义。Hu等 5基于基因表达分析仪(GeXP)建立了多重RT-PCR检测方法,该方法能同时检测JEV、CSFV、PRRSV、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、非洲猪
12、瘟病毒(African swinefevervirus,ASFV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)和猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)共7 种猪病原体,其敏感性达到10 10 0 0 copies/L,对多个临床样品进行分析与常规PCR方法相比,GeXP-PCR具有100%的特异性。1.2qPCR实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quan-titative PCR,q PCR是近年发展起来的一种实验室检测技术,它既能有效地解决PCR检测时出现假阳性问题,又能够对核酸进行定量,具有比普通PC
13、R更高的敏感性和特异性。孙莉等 6 以JEV3UTR区域为靶标设计引物和TaqMan-MGB探针,建立了一步法qPCR方法,其变异系数在0.46%0.53%之间,检测极限为5copies/L,对15份临床血清样本的检测结果与JEV检测试剂盒(北京华大吉比爱生物技术有限公司)结果一致,说明该方法具有较高的灵敏度和特异性。由于JEV存在多种基因型,其中JEV基因1型(G1)和3型(G3)是亚洲最流行的毒株,为了快速区分JEVG1和G3,Wang等 7 以G1和G3型的prM/M基因作为靶标设计双重TaqMan RT-qPCR引物和探针,建立了一种对JEV基因快速分型的方法,该方法对野外蚊子和猪样本
14、中的JEVG1和G3型的灵敏度均为10 copies,比普通PCR方法更特异、敏感,能在1h内完成检测。目前,JEVG1和G3型的混合感染在中国东部地区的猪或蚊子中较为普遍,因此,这种双重TaqManRT-qPCR为JEVG1和G3型毒株的快速鉴别检测和流行病学调查提供了技术支持。Barros等 8 针对JEVNS2A基因设计了1对引物和2 条探针,建立了能区分WNV和JEV的双重 TaqMan RT-PCR,该方法对两种病毒的检测极限均为10 copies,与其他虫媒病毒无交叉反应,具有高特异性和敏感性。在生产中由于猪精液中携带的病毒易导致病毒的扩散,给养猪业造成了巨大经济损失,而针对猪精液
15、中RNA病毒却缺乏有效的检测方法。鉴于此,王婕敏 9 建立了同时对猪精液中PRRSV、CSFV 和JEV进行检测的三重RT-qPCR检测方法,其灵敏度分别为18.2 4、10、10 copies,对15个猪场采集的10 9份猪精液样品进行检测,结果显示:JEV总阳性率达到了2 0.2%(2 2/10 9),这表明JEV是猪场较为普遍的一种繁殖障碍性疾病相关病原,而利用该方法有助于繁殖障碍类疾病相关病原的净化和根除。Xu等 10 设计了携带3种不同标记基团FAM、VI C和CY5的TaqMan探针,开发了两种多重TaqManRT-qPCR方法,可同时检测6 种虫媒病毒JEV、W NV、寨卡病毒(
16、Zikavirus,ZIKV)、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus,CH IK V)、登革热病毒242第54卷中国兽医科学(D e n g u e v i r u s,D ENV)、黄热病病毒(Yellowfevervirus,YFV),其检测限均低至5copies,批间与批内的变异系数分别为0.2 4%3.2 1%和0.2 3%1.76%,对38 个临床样本(包括血浆、血清和尿液样本)进行检测,结果与商业化单一RT-qPCR试剂盒(迈布斯凯生物科技有限公司)的符合率为10 0%JEV等虫媒病毒的共同传播,不仅带来了养殖场成本增加和公共卫生安全等问题,而且给鉴别诊断,特别是血清学和
17、分子生物学鉴别带来了挑战。此外,蚊子作为一种重要的传播媒介,是多种黄病毒的储存宿主和传染源,将蚊子纳人监测对象可作为检测某些重要的黄病毒疫情的早期预警手段。1.3LAMP环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal am-plification,LAMP)是在恒温条件下进行靶基因扩增的一种新技术。Xu等 开发了Rapidvisual CRISPR(RAVI-CRISPR)检测方法,能在1h内完成样品检测,JEVC基因的检测限为8.97 copies,与猪的其他病原体没有交叉反应性,应用RAVI-CRISPR对18 份组织样本进行检测,其可视化的结果与RT-qPCR分析的结果
18、一致,表明RAVI-CRISPR可用于临床和载体样本中JEV的现场检测。Liu等 12 针对JEVE基因开发了用于检测猪和蚊子中的JEV的RT-LAMP方法,通过检测56 份猪血清样本和2 0 0 0 0 只蚊子对该方法进行评估的结果表明,与病毒分离鉴定结果相比完全一致,对猪血清样本和蚊子样本检测限分别为2.57 和2 copies,检测灵敏度与RT-qPCR相似,比传统RT-PCR高10 倍,可在50 min内完成。该方法可准确、快速检测猪和蚊子体内的JEV,是监测JEV的实用分子手段。Tian等 13 基于JEVNS3基因建立了一种荧光染料指示的实时RT-LAMP方法,用于细胞培养物和猪体
19、样本中JEV的检测,该方法在20L体系下对样本中JEV的检测限为8.13PFU/mL,可在35min内完成,比传统RT-LAMP方法更灵敏、更快速,该方法避免了因样品制备过程中的污染而产生假阳性结果。Ahn等 4 开发了JEV纳米条形码和比色反转录环介导的等温扩增(cRT-LAMP)方法,在cRT-LAMP测定中,将特定的纳米金颗粒(AuNP)条形码添加到JEVRT-LAMP扩增子中,形成稳定的LAMP-AuNP条形码复合物结构,随后利用AuNP:聚腺嘌呤(A10)-JEVRT-LAMP纳米条形码的盐诱导聚集原理通过比色测定来鉴定JEV扩增子,而盐诱导的JEV特异性纳米条形码因聚集而产生肉眼可
20、见的颜色变化(粉红色至紫色),进而验证样品有无阳性信号;该方法对JEV的检测限为1copies/L,可在30 min内完成并能直接从尿样中检测JEV,与常规RT-PCR灵敏性基本一致,与ZIKV、DENV2D ENV4型无交叉反应,具有高特异性和敏感性,能够为偏远地区的JEV检测提供一种实用手段。氧化锌(ZnO)纳米颗粒对核酸具有良好吸附作用和导热性,与更常用的纳米金粒子相比,具有表面积大、经济、环保等优点。目前,利用ZnO纳米材料作为RT-LAMP检测的优化剂来检测各种疾病的报道很少,而Ma等 15 成功开发了一种ZnO纳米结构辅助RT-LAMP来检测JEV,与传统RT-LAMP实验相比,在
21、0.6 1.2 nmol/L范围内添加ZnO纳米颗粒可以优化RT-LAMP反应,且以1 nmol/L为ZnO纳米颗粒的最佳浓度,该方法对JEV的检测可在6 0、30min内完成,对临床样本进行检测与普通PCR相比,其灵敏性比普通PCR高约10 0 倍。1.4ddPCR微滴数字PCR(D r o p l e t d i g i t a l PCR,d d PCR)是一种新型的实验室检测技术,无须使用标准样品即可实现核酸定量,目前已用于病原体诊断、基因突变检测和转基因研究等应用。Wu等 16 基于JEVNS5基因设计引物和探针开发了RT-ddPCR方法,该方法线性相关性良好(R0.999),通过分
22、析10 3份猪临床样本,将其与TaqMan RT-qPCR进行比较的结果表明,RT-ddPCR的阳性检出率(2 7.2%)高于TaqManRT-qPCR的阳性检出率(16.5%),检测限约为2 copies/20L,灵敏度比TaqMan RT-qPCR高100倍。张俊锋等 17 根据JEVNS1基因和WNVNS4B基因开发了双重RT-ddPCR检测方法,对JEV和WNV的检测灵敏度均可达到10?copies/L,在高浓度和低浓度模板下变异系数均较小,与多种病毒无交叉反应、说明该方法的可重复性、特异性良好,为这2种病毒的检测提供了可靠的解决方案。JEV感染初期,宿主体内病毒含量水平较低,使得从临
23、床样本中分离或检测病毒非常困难,而新型RT-dd-PCR拥有更好的分析灵敏度,这有助于提高临床样本的阳性检出率,起到“早发现”的作用,有利于猪场繁殖障碍疾病的监测,也有利于公共卫生安全。2免疫学检测技术2.1酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunoso-rbent assay,ELISA)由于JEV病毒血症持续期短,在脑脊液(CSF)或血清样本中很难检测到JEVRNA,因而日本乙型脑炎的诊断主要依据之一是检测血清样本中有无JEV特异性抗体。Zhou等 18 开发了一种用于检测JEV的何243松等:猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展第2 期阻断ELISA(blockingE
24、LISA,bELISA)方法,对免疫后第7 天的157 份猪样品进行现场检测,与商业化iELISA试剂盒对比检测结果的一致性为98.7%,表明bELISA有高灵敏度和特异性,可用于感染或免疫后JEV早期抗体的检测,也为JEV感染的血清学监测和疫苗接种后猪的免疫状态评估提供了的方法。Chauhan等 19 基于JEVNS1蛋白开发了试纸条ELISA检测方法,试纸条ELISA的相对诊断灵敏度和特异性分别为10 0%和92.9%,4下试纸条的保存期可达7 个月,并且检测结果可视化,无须其他设备,可用于偏远地区JEV的现场检测。Jia等 2 0 开发了对IgG定性和定量的ELISA方法,对9个养猪场的
25、7 4份血清样本进行检测,与间接ELISA进行比较,结果符合率为8 5.1%(6 3/7 4),对46 例猪血清样品进行定性检测,获得了8 例猪阳性血清样品,表明ELISA具有较高的特异性、敏感性和重复性。IgM捕获ELISA(Monoclonal antibody captureELISA,MacELISA)是目前诊断JEV最广泛的方法,早期开发的MacELISA在宿主感染JEV后出现临床症状的第2 天就能检测到特异性IgM,但该方法存在检测时间长、特异性较差等诸多缺陷。而Mali等 2 1构建了表达JEVG1E基因的BHK-21细胞,利用重组E蛋白作为检测抗原,成功建立了检测JVE特异Ig
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 日本 脑炎 病毒 新型 检测 方法 研究进展
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。