重组小反刍兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化.pdf
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1、D79-08ChineseVeterinaryScience网络首发时间:2 0 2 2-12-142024,54(01):79-86中国兽医科学0l:10.16656/j.issn.1673-4696.2023.0043中图分类号:S852.659.5文献标志码:A文章编号:16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 1-0 0重组小反兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化胡林杰朱学亮彭泓蛟邓瑞雪潘春容孙跃峰蒙学莲*(中国农业科学院完兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室,甘肃青兰州730046)摘要:本试验利用发酵技术诱导表达了小反幺兽疫病毒H蛋白胞外区(PPRVtH),优化建立了一套纯化
2、重组PPRVtH的完整工艺体系。通过发酵表达获得的10 L菌液,菌体湿重约达30 g/L,,均质机破碎菌体获得包涵体;Tris-0缓冲液(pH=8.0)洗涤包涵体3次,每1g包涵体加入5mL含2 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液(pH=8.0)重悬,4温和旋转溶解过夜,离心收集上清;按体积比1:2 将层析填料ChelaingSepharoseFastFlow与上清混匀,以流速12 mL/min加入层析柱;依次通过10 倍柱体积含50、10 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液(pH=8.0),4静置2 h进行洗脱。优化后的纯化体系可得到较纯的重组PPRVtH蛋
3、白,利用灰度分析可知纯化后的重组PPRVtH蛋白纯度能达到8 5%。本试验提供的纯化体系可快速、简便、低成本、大批量纯化重组PPRVtH蛋白,而且纯化获得的PPRVtH蛋白具有良好的反应原性关键词:小反幺兽疫病毒;血凝素蛋白;蛋白纯化;优化Optimization of the purification system of recombinant hemagglutininprotein from peste des petits ruminants virusHU Linjie,ZHU Xueliang,PENG Hongjiao,DENG Ruixue,PAN Chunrong,SUN Y
4、uefeng,MENG Xuelian*(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academyof Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China)Abstract:In this experiment,the extracellular domain of hemagglutinin of peste des petits ruminantsvirus(PPRV tH)was
5、expressed by fermentation technology,and a complete purification system for PPRV tHwas established by optimization.The cell wet weight was about 30 g per liter of culture broth by fermentation.The inclusion body was obtained by homogenizer and washed three times with Tris-0 buffer(pH=8.O).Thenper l
6、g of inclusion bodies was resuspended with 5 mL Tris-E buffer(pH=8.0)containing 20 mmol/L imidazole,and dissolved overnight at 4 C by gentle rotation.The supernatant was retained by centrifugation.TheChelaing Sepharose Fast Flow was mixed with the supernatant at a volume ratio of 1:2 and added to th
7、ecolumn at a flow rate of 12 mL/min.The recombinant PPRV tH was eluted by passing through 10 times thecolumn volume of Tris-E buffer(pH=8.0)with a stepwise gradient of imidazole(50,100,400 and 500 mmol/L)for2 h at 4 C.The purity of purified recombinant PPRV tH protein using optimized purification sy
8、stem canreach 85%by gray scale analysis.Its fast,simple,low cost and higher final purity properties make itexcellent for purifing the recombinant PPRV tH in this experiment and the purified PPRV tH protein hasgoodreactogenicity.Key words:peste des petits ruminants virus;haemagglutinin protein;protei
9、n purification;opti-mization收稿日期:2 0 2 2-11-14;修回日期:2 0 2 2-12-0 7基金项目:边境地区和重要口岸动物病原监测溯源技术研究项目(2 0 2 1YFD1800500);兰州市人才创新创业项目(2 0 2 2-RC-22)作者简介:胡林杰(1998-),男,湖北利川人,硕士生,主要从事动物传染病预防和控制相关研究,E-mail:h u l i n j i e 0 315 16 。*通讯作者:蒙学莲(197 5-),女,甘肃靖远人,副研究员,博士,主要从事病原分子生物学与免疫学方面的研究,E-mail:。80第54卷中国兽医科学*Corr
10、esponding author:MENG Xuelian,E-mail:小反台兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus),是一种有囊膜的单股负链RNA病毒,感染山羊、绵羊等小反台动物引起一种具有高度传染性的烈性疾病-与小反含兽疫(pestedespetitsruminants,PPR)。PPR最早记载发生于非洲,现已蔓延到包括中东、亚洲和欧洲在内的约7 0 个国家和地区2-31,每年造成15亿2 0 亿美元的经济损失。PPR被OIE列为法定必须报告的动物疫病,我
11、国将其规定为一类动物疫病。PPR于2 0 0 7 年首次传人我国,虽然在有效的措施下控制了疫情,但2 0 13年该病再次从新疆传人并迅速波及全国,严重危害了我国的养羊业,成为困扰养殖业持续健康发展的一个突出问题4。2 0 12 年国务院办公厅明确将PPR列人13种重点防范的外来动物疫病。2 0 15年,FAO和OIE组织在科特迪瓦召开全球部长级会议,通过并启动全球小反台兽疫控制与根除策略。PPRV基因组从3 端至5 端依次分布着6 个基因 N-P-M-F-H-L,对应编码6 种结构蛋白和2 种非结构蛋白5-7 ,其中H基因编码含有6 0 9个氨基酸的血凝素(hemagglutinin,H)蛋白
12、,包括N末端胞质尾区、跨膜区(TM)、茎区(Stalk)和与受体结合的C末端头结构域(headdomain)8)。H 蛋白是一种I型跨膜糖蛋白,构成病毒粒子表面的纤突,具有神经氨酸酶活性和血凝素作用,且含有T细胞决定簇,是麻疹病毒属结构蛋白中最易变异的蛋白。作为病毒表面的主要抗原成分,H蛋白与宿主细胞表面病毒受体发生结合,调节病毒吸附并侵人细胞,诱导机体产生中和抗体,参与体液保护性免疫9随着对PPRV研究的不断深入,关于表达PPRVH蛋白的报道日益增多。Seth10等利用哺乳动物细胞表达的PPRVH蛋白也具有生物活性。Balamurugan等1 通过Vero细胞系表达了PPRVH蛋白,并评估了
13、其作为酶联免疫吸附反应诊断抗原的潜力。蒙学莲等12 1分别利用原核和真核表达系统研究了PPRVtH蛋白的表达特点。李丹等13 利用原核表达系统制备的PPRVH蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,能诱导小鼠产生保护性中和抗体。虽然国内外学者利用多种表达系统对重组PPRVH蛋白的表达条件进行了研究,但关于重组PPRVH蛋白的纯化条件还没有确定,尤其是适用于批量化纯化工艺参数。在生物材料和技术的发展下,蛋白纯化通用型工艺已成熟,但就特定蛋白的个性化纯化工艺仍需确定。因此,本试验从蛋白纯化技术的各个环节着手,利用不同的生物材料,优化建立了一种操作简单、效率高、成本低廉的重组PPRVtH蛋白纯化工艺体系。
14、1材料与方法1.1重组菌株、血清携带pET30a-tH重组菌BL21(D E3)和绵羊抗PPRV阳性血清均由本实验室保存1.2主要试剂HRP标记的家兔抗小鼠IgG、H RP标记的家兔抗山羊IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。Ni-NTAAgarose 购自QIAGEN公司。Ni Sepharose FastFlow购自cytiva公司。Chelaing SepharoseFastFlow购自百川开泰生物技术(北京)有限公司。其它试剂均为国产分析纯1.3主要溶液Tris-0缓冲液:Tris2.42g,NaCl11.6g,加适量水溶解,分别调pH值至6.5、7.4、8.0、8.3,定容到1 000
15、mL。PBS-0 缓冲液:0.5mol/LNaH,PO19mL,0.5mol/LNazHPO481mL,NaCl29.3g,加适量水溶解,分别调pH值至6.57.4、8.0、8.3,定容到10 0 0 mL;Tris-1缓冲液:Urea360g,加Tris-0缓冲液(pH值为8.0)溶解,定容至10 0 0 mL;T r is-2 缓冲液:咪唑34g,Urea360g,加Tris-0缓冲液(pH值为8.0)溶解,定容至10 0 0 mL;PBS-1缓冲液:Urea480g,加PBS-0缓冲液(pH值为7.4)溶解,定容至10 0 0 mL;PBS-2缓冲液:咪唑34g,Urea480g,加PB
16、S-0缓冲液(pH值为7.4)溶解,定容至10 0 0 mL。表1不同咪唑浓度Tris-E/PBS-E缓冲液配制Table1Preparation of Tris-E/PBS-E buffer with differentimidazole concentrationsTris-1/PBS-1Tris-2/PBS-2咪唑浓度/(mmol-L-)缓冲液/mL缓冲液/mL10982209645090108084161008020200604030040604002080500010081胡林杰等:重组小反乌兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化第1期1.4重组蛋白诱导表达条件的优化将复苏的携带pET30
17、a-tH重组菌BL21(DE3)按照1%接人含卡那霉素的LB培养基中,37 培养3h,加人0.2 mmol/LIPTG30诱导8 h。按照此条件分别利用摇床、发酵罐进行诱导表达,分别收集、称重两种条件下表达的菌体。每1g湿重菌体重悬于10 mLPBS-0(p H=7.4),均质机(ATS)破碎(1 000 bar,100mL/min)2次,130 0 0 r/min离心15min,收集沉淀(即包涵体)。取1g包涵体溶解于5mLPBS-1缓冲液中,4温和旋转过夜,4、12 0 0 0r/min、离心30 min,收集上清;取上清液7 5L与2 5L4蛋白Loadingbuffer混匀后制样,每孔
18、上样15L进行SDS-PAGE分析1.5蛋白纯化缓冲液的优化取两等份包涵体,分别用pH值为7.4的PBS缓冲液和Tris缓冲液进行纯化,具体步骤如下:分别利用Tris-0、PBS-0 缓冲液洗涤包涵体,4、4000r/min、离心30 min,弃上清,收集沉淀,重复洗涤3次;称取洗涤后的包涵体,每1g包涵体溶解于5mL含2 0 mmol/L咪唑的Tris-E或PBS-E缓冲液中,4温和旋转过夜,4、12 0 0 0 r/min、离心30min,收集上清(即粗蛋白溶液);按体积比1:8 将层析填料与上清混匀,亲和结合,形成结合悬液;将结合悬液以流速12 mL/min加入层析柱;依次通过10 个柱
19、体积含不同浓度(2 0、50、8 0、10 0、2 0 0、400、50 0 m m o l/L)咪唑的Tris-E或PBS-E缓冲液进行洗脱,除去未结合的PPRVtH蛋白和其他蛋白,得到纯化的重组PPRVtH蛋白,进行SDS-PAGE检测1.6蛋白纯化缓冲液pH值的优化取4g包涵体,分成4等份。配制含不同咪唑浓度的Tris-E缓冲液各4等份,分别将pH值调至6.5、7.58.0、8.3,按照1.5的操作步骤进行纯化和检测1.7蛋白和填料结合时间的优化取40 mL粗蛋白溶液,分成5等份,分别在直接加入层析柱(0 h)及4温和旋转1、2、4、8 h条件下与1mL的填料结合,结合后按照1.5步骤操
20、作,依次用含40、8 0、10 0、50 0 mmol/L咪唑的洗脱液(pH=8.0)进行洗脱,SDS-PAGE检测1.8蛋白洗脱时间的优化取2 4mL粗蛋白溶液,分成3等份,每份粗蛋白溶液与层析填料混匀后直接加人层析柱,加人洗脱液后分别于4静置0、2、4h后再收集洗脱的蛋白溶液,依次加入的不同咪唑浓度洗脱液均根据组别静置相同的时间,其余纯化步骤同1.5,进行SDS-PAGE检测1.9层析填料的筛选取2 4mL粗蛋白溶液,分成3等份,分别与三种不同公司的填料(Ni-NTAAgarose、c y t i v a Ni Se p h a r o s eFastFlow、Ch e l a i n g
21、 Se p h a r o s e Fa s t Fl o w)进行结合;加人洗脱液后静置2 h后再收集蛋白溶液,其余纯化步骤同1.5,进行SDS-PAGE检测1.10层析填料用量的优化取14mL粗蛋白溶液,分成3等份,按不同体积比(1:2、1:4、1:8)将层析填料ChelaingSepharoseFastFlow与粗蛋白溶液分别结合,按照1.9步骤进行纯化,SDS-PAGE检测1.11Western-blot检验将未诱导菌体、诱导表达菌体、纯化的tH蛋白的样品进行Western-blot试验,一抗选用绵羊抗PPRV阳性血清,二抗选用HRP标记家兔抗山羊IgG。2结果2.1重组蛋白诱导表达条
22、件的优化在摇床中小量诱导表达的菌体湿重约3g/L,大量发酵诱导表达的菌体湿重约30 g/L,可知发酵大量诱导表达菌体约为小量诱导表达的10 倍。重组PPRVtH蛋白的相对分子量约6 8 ku(图1),发酵诱导的蛋白表达量明显大于在摇床中诱导的。M12M3475ku50ku图1不同条件下诱导表达重组pET30a-tH蛋白的比较Figure 1 Comparison of expression levels of recombinant pro-tein pET30a-tHinduced under different conditionsM:预染蛋白Marker;l:在摇床中诱导表达的pET30
23、a-tH;2:在摇床中用IPTG诱导表达的pET30a-Th;3:在发酵罐中诱导表达的pET30a-Th;4:在发酵罐中用IPTG诱导表达的pET30a-tH。M:Pre-stained protein marker;1:pET30a-tH without induction in shaker;2:pET30a-tH induced with IPTG in shaker;3:pET30a-tH without induc-tion in fermentor;4:pET30a-tH induced with IPTG in fermentor.2.2蛋白纯化缓冲液的优化本研究对比了磷酸盐缓冲
24、液和Tris缓冲液对蛋白纯化效果的影响。由结果可知(图2),利用磷酸82第54卷中国兽医科学盐缓冲液进行纯化时,2 0 mmol/L咪唑洗脱出现了明显的目的条带,但是杂蛋白比较多,其他咪唑浓度洗脱蛋白条带很弱或没有条带;Tris缓冲液纯化时,不同浓度咪唑洗脱均出现了目的蛋白条带,其中40 0 和50 0 mmol/L咪唑洗脱的目的蛋白纯度较高。因此,确定Tris缓冲液更适合用于PPRVtH重组蛋白的纯化。M123456M789101112131475ku75ku一60 ku60ku一图2 缓冲液对pET30a-tH重组蛋白纯化效果比较Figure 2 Comparison of purific
25、ation effect of recombinant protein pET30a-H using different buffersM:预染蛋白Marker;1、7:流穿液;2 6:分别用含2 0、8 0、10 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱的产物;8 14:分别用含2 0、50、8 0、100、2 0 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;land 7:Flow through liquid;2-6:Products eluted by PBS buffer with
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