猪圆环病毒2型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备.pdf

226-07D网络首发时间：2 0 2 3-11-0 72024,54(02):226-232中国兽医科学2 0 2 4,54(0 2)Chinese VeterinaryScience01:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0030中图分类号：S852.659.2文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 2-0猪圆环病毒2 型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备边孟婷，梁海英，曾智勇*，汤德元，王彬，叶泥，柳佳佳，黄书，潘向英，田红利（贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)摘要：为了鉴定并深入研究ORF9蛋白在猪圆环病毒2 型感染中的作用，本研究制备了小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体并进行了初步应用。首先通过扩增克隆ORF9基因，构建原核表达质粒pET-32a（十）-PCV2-ORF9并转化至BL21(DE3)感受态细胞中，再利用SDS-PAGE对可能影响ORF9蛋白表达效果的因素（温度、IPTG浓度、时间）进行优化研究，随后将重组蛋白经纯化复性后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，用ELISA测定小鼠多抗效价，并用IFA和Western-blot方法对抗ORF9多克隆抗体特异性进行研究。结果显示，重组质粒pET-32a(+）-PCV2-O RF9构建成功；ORF9重组蛋白在IPTG浓度为0.1mmol/L、37 条件下诱导4h表达量最高，且主要以包涵体形式表达，分子量大小约2 4.2 ku;经ELISA检测制备的多抗效价为1:6 40 0；IFA和Western-blot试验结果均证明ORF9蛋白能被PCV2阳性血清和小鼠多克隆抗体特异性识别。本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV2ORF9重组蛋白，制备的特异性抗PCV2ORF9多克隆抗体为探究ORF9蛋白在PCV2感染中的作用奠定了基础材料。关键词：猪圆环病毒2 型；ORF9蛋白；原核表达；多克隆抗体Prokaryotic expression of porcine circovirus virus type 2 ORF9 proteinand preparation of its polyclonalantibodiesBIAN Mengting,LIANG Haiying,ZENG Zhiyong*,TANG Deyuan,WANG Bin,YE Ni,LIU Jiajia,HUANG Shu,PAN Xiangying,TIAN Hongli(College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)Abstract:In order to identify and further investigate the role of the ORF9 protein in porcine circovirustype 2 infection,a murine polyclonal antibody against ORF9 protein was prepared and carried out preliminaryapplication.First,the ORF9 gene was cloned and the ORF9 protein prokaryotic expression plasmid pET-32a(+)-PCV2-ORF9 was constructed and transformed into Transetta(DE3)expression strains.The optimumconcentration of IPTG induction temperature and induction time of the ORF9 expression were investigatedby SDS-PAGE method.BALB/c mice were immunized with the target protein after purification and renatu-ration.The titer of polyclonal antibody against ORF9 was determined by ELISA,and the specificity ofpolyclonal antibody against ORF9 was studied by IFA and Western-blot.The results showed that the recom-binant plasmid pET-32a(+)-PCV2-ORF9 is constructed successfully.The optimum IPTG concentration,temperature and induction time of ORF9 protein expression were 0.1 mmol/L,37 C and 4 h,respectively,and it was mainly expressed in the form of inclusion bodies with molecular weight of about 24.2 ku.The收稿日期：2 0 2 3-0 9-0 5；修回日期：2 0 2 3-11-0 3基金项目：贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑【2 0 2 1 一般16 2 项目）作者简介：边孟婷（1998-），女，贵州黔东南人，硕士生，研究方向为动物传染病病原分子生物学，E-mai1：11940 0 97 50 q 。*通讯作者：曾智勇（197 8-），男，四川威远人，研究员，博士，主要从事动物传染病病原分子生物学的研究，E-mail:。227第2 期边孟婷等：猪圆环病毒2 型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备antibody titer detected by ELISA could reach 1:6 400.Both IFA and Western-blot results showed that theprotein could be specifically recognized by PCv2 positive serum and murine polyclonal antibody.Therecombinant ORF9 protein of PCV2 with antigenicity was successfully expressed and purified,the murinepolyclonal antibodies laid the basis for an in-depth study of the role of ORF9 in PCv2 infection.Key words:porcine circovirus type 2;ORF9 protein;prokaryotic expression;polyclonal antibody*Corresponding author:ZENG Zhiyong,E-mail:猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV)是目前已知最小的DNA病毒,PCV2被认为是猪圆环病毒相关疾病(PCVD或PCVAD)的重要病原体,这些疾病以PCV2临床感染或亚临床感染为主要特征,其中PMWS是临床中最常见的疾病 。猪圆环病毒(PCV)于197 4年首次在德国被认为是猪肾细胞培养物中细胞污染物 2 。198 2 年,Tischer等研究发现这种细胞中的污染物是一种DNA病毒,将其命名为PCV3。1991年，加拿大西北部爆发了断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）,最终确定病原为PCV,但与以前发现的PCV在基因上存在显著差异,随后将非致病性PCV命名为猪圆环病毒1型(PCV1),引起猪感染发病的命名为猪圆环病毒2 型(PCV2)41。PCV2基因组序列可分为9个基因型:PCV2a2i,其中2 a2 d 在世界范围内均流行,2 0 0 2 年之前，PCV2在我国的优势流行毒株主要为PCV2a，20022 0 0 8 年之间转变成PCV2b，自2 0 12 年以来，PCV2d基本上取代了占主导地位的PCV2b流行毒株 5。PCV2可以编码11个开放阅读框openreadingframe,ORF),ORF1、O RF5、O RF7 和ORF10位于病毒基因组正链，其余位于负链上，不同的ORF间存在相互重叠现象增加了PCV2基因组的利用率,可能是生物进化过程中自然选择的结果 6 迄今为止，已有7 个编码蛋白被发现和鉴定，分别为ORF17。O RF1基因主要编码复制酶蛋白Rep和Rep,与病毒复制有关 7 。ORF2基因编码的衣壳蛋白(Cap)是组成病毒衣壳的唯一结构蛋白和主要免疫原性蛋白 8 。ORF3基因与PCV2的致病机理有关，又称为调亡蛋白 9。ORF4完全重叠在ORF3内，又称为调亡抑制基因，可能通过抑制ORF3的转录从而阻止病毒所诱导的凋亡 10 1。ORF5基因编码蛋白定位于内质网（ER），可以通过PERK-eIF2-ATF4和AMPK-ERK1/2-mTOR途径促进病毒复制 1。ORF6 编码蛋白定位于细胞浆内,不是病毒复制所必需的基因，可能参与半胱天冬酶调节和PCV2感染细胞中多种细胞因子的表达 12 。ORF7蛋白能够促进PK-15细胞内质网应激反应、缩短细胞周期、抑制细胞调亡、促进天然免疫应答，对PCV2复制产生影响 13。经预测,在PCV2基因组中还存在一些新的ORFs,即ORF811,但其在病毒感染中是否存在编码产物和功能还需要进一步研究。ORF9位于PCV2病毒负链，由12 9个核苷酸组成,本研究在PCV2感染细胞中通过qPCR检测到了ORF9mRNA的存在，为探究ORF9在感染细胞中的蛋白表达及其在病毒感染中的潜在功能，试验构建并表达、纯化了ORF9重组蛋白，制备了抗ORF9蛋白的多克隆抗体，以期为ORF9蛋白在PCV2感染中的作用研究奠定材料基础，1材料与方法1.1材料PCV2分离株（PCV2-GZGD2022）原核表达载体pET-32a（十）为实验室保存。大肠杆菌感受态细胞DH5和BL21(DE3)均购自重庆擎科生物科技有限公司。胶回收试剂盒购自OMEGA生物有限公司。His标签蛋白纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。SDS-PAGE快速凝胶试剂盒、考马斯亮蓝染色液均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自大连宝日医生物工程有限公司。BALB/c小鼠(SPF级、6 8 周、雌性）购自斯贝福（北京)生物技术有限公司1.2试验方法1.2.1引物设计与合成根据本实验室前期分离鉴定的PCV2-GZGD2022毒株基因组序列,设计并合成1对引物,用于扩增PCV2的ORF9基因,引物序列为 F:5-CGCGGATCCATGTGGTTGGGGTC-CGCTTCT-3,R:5-CCCAAGCTTTTATCGCTGA-AAACGAAAGAAGTGC-3引物由重庆擎科生物技术有限公司合成1.2.2基因扩增与原核表达质粒的构建以 PCV2-GZGD2022分离株提取的核酸为模板,PCR扩增体系为:10 XBuffer2.5L,dNTP4.0L,ddH,O11.75L,LATaq0.25L，模板4.5L，上、下游引物各1L。反应程序为：94预变性5min;94变性30 s，56退火30 s，7 2 延伸30 s；共35个循环；7 2 再延伸10 min。将ORF9的胶回收产物与空载体228第54卷中国兽医科学pET-32a（+）分别经BamHI、H a n d III双酶切,将纯化的ORF9基因酶切片段与载体pET-32a（+）相连接,转化至DH5a感受态细胞，进行酶切鉴定正确后送至重庆擎科生物科技有限公司测序1.2.3重组蛋白表达的优化及表达形式确定将测序鉴定正确的重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,取鉴定正确的重组菌液10 0 L接种于10 mL的含有Amp的LB液体培养基中,在37 恒温震荡摇床中培养至OD值0.6 0.8，相同条件下培养质粒pET-32a（+）菌液作为对照，对可能影响诱导表达的条件（温度、IPTG浓度、时间）进行优化。同时,验证ORF9蛋白的表达形式,即将2 mL重组菌液12 0 0 0 r/min离心1min，收集菌体，用PBS清洗3次后，加入48 L的PBS和12 L的5蛋白上样液，于沸水中煮10 min，冷却后进行SDS-PAGE，拍照记录结果1.2.4重组蛋白的纯化与复性将重组质粒pET-32a（十）-PCV2-ORF9经大量诱导表达后，使用蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。纯化蛋白按照尿素梯度稀释法进行蛋白复性，复性后的蛋白经BCA法测定浓度。1.2.5重组蛋白的Western-blot鉴定将重组蛋白经12%SDS-PAGE后转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液在室温振荡封闭2 h后，以小鼠抗6 His标签的一抗（1：40 0 0）4孵育过夜,结束后用TBST漂洗3次，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1：50 0 0)为二抗，在室温振荡孵育1h,孵育结束后用TBST漂洗3次，显色记录结果1.2.6多克隆抗体的制备将复性后的重组蛋白与完全弗氏佐剂按照1：1比例，用两个1mL注射器来回推动，充分混合制备乳剂，采用背部多点注射完成第1次免疫。第1次免疫后10、2 0、30 d,用弗氏不完全佐剂按照上述方法完成第1、2、3次加强免疫。在加强免疫结束后第10 天小鼠断头采血，收集血清。1.2.7多克隆抗体效价测定参照徐贝贝等 14 操作步骤，将纯化后的PCV2ORF9蛋白以5mg/L、每孔10 0 L包被至ELISA板中，于37 恒温培养箱中孵育2 h；孵育结束后加人10 0 uL的封闭缓冲液(BSA），于37 封闭1h;将制备的小鼠血清按照1:200、1:40 0、1:8 0 0、1:16 0 0、1:32 0 0、1:6 40 0、1：12 8 0 0 的梯度稀释后，取10 0 L稀释后的血清加入包被板中，于37 孵育1h；加人10 0 L的1：30 0 0 稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，于37恒温培养箱中孵育1h；加人10 0 L的ELISA显色液，于2 5恒温培养箱中避光显色30 min；最后加人10 0 L的ELISA终止液终止试验。每一次操作后每孔用2 0 0 L的PBST清洗3次。用酶标仪检测D450值，当P/N2.0、N 1时判为阳性,以阳性血清最大稀释倍数为多克隆抗体的效价。1.2.8Western-blot鉴定多克隆抗体将纯化蛋白经12%SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h后，以制备的小鼠血清为一抗（1：10 0 0)于4孵育过夜,结束后用TBST漂洗3次；以HRP标记山羊抗小鼠IgG（1：50 0 0抗体为二抗，室温孵育1h,孵育结束后用TBST漂洗3次，显色记录结果1.2.9IFA鉴定多克隆抗体将长势良好的PK15细胞按一定比例平铺于2 4孔板中，待细胞长至约70%后倒掉营养液，加人2 0 0 L病毒液，于37、5%COz细胞培养箱中孵育1h后,加人1ml含10%胎牛血清培养基，继续培养48 h后,用4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，以1：2 0 0 稀释制备的小鼠血清为一抗，于37 孵育1h后，以1：2 0 0 稀释的FITC标记的山羊抗小鼠抗体为二抗，于37 下孵育1h后，置于倒置荧光显微镜下拍照记录结果。2结果2.1基因扩增与原核表达质粒的构建PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1条大小约为147 bp的目的片段,大小与预期一致,将ORF9基因连接至载体pET-32a（十），构建重组质粒pET-32a（+）-PCV2-O RF9。以内切酶HindIII进行单酶切鉴定，以内切酶Hind III和BamHI进行双酶切鉴定，结果表明重组质粒构建成功（图1）。2.2重组蛋白表达的优化及表达形式确定将IPTG终浓度设为1.0 mmol/L，诱导时间设为5h，重组菌液分别在2 6、30、37 条件下诱导培养，确定最佳诱导温度为37（图2 A）。将诱导温度设为37,诱导时间设为5h,重组菌液分别在IPTG终浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L条件下诱导培养，确定IPTG的最佳诱导终浓度为0.1mmol/L（图2 B)。将诱导温度设为37,IPTG终浓度设为0.1mmol/L，诱导时间分别为1、2、3、4、5h进行诱导培养，确定最佳诱导时间为4h（图2 C）。取最适条件下诱导菌体经超声破碎离心后，收集上清及沉淀，进行SDS-PAGE检测。结果显示，蛋白主要存在于细菌沉淀中（图2 D）。2.3重组蛋白的纯化与复性对经试剂盒纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE229第2 期边孟婷等：猪圆环病毒2 型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备M1M2M3M4ABCD8 000 bp5000bp8000bp3.000bp8 000 bp5000bp20006P2.000bp3000bp1500bp5000bp3.000bp2000bp1 000 bp1500bp1 000 bp1500 bp2 000 bp1 000 bp750bp750bp750bp1000bp500 bp500bp500bp750 bp500bp250bp250bp250 bp250bp100 bp100bp100 bp100 bp图1ORF9基因的扩增与原核表达质粒pET-32a(+）-PCV2-O RF9的构建Figure 1 Amplification of ORF9 gene by PCR and construction of pET-32a(+)-PCV2-ORF9 prokaryotic expression plasmidM:DNA分子质量标准；1.ORF9PCR扩增产物；2：重组质粒；3：重组质粒单酶切；4：重组质粒双酶切。M:DL2000/8000 DNA marker;1:PCR product of ORF9 gene;2:Recombinant plasmid;3:Recombinant plasmid by single digestion;4:Recombinantplasmid by double digestion.M12345M67891011 12M 13 14 15 16 17 18 19M 2121ABCD53ku53ku53ku53ku40ku40 ku40ku40ku33ku33ku33ku33ku25ku25ku25ku25ku17ku17ku17ku17ku10ku10ku10ku10ku图2 ORF9重组蛋白的诱导表达优化及表达形式确定Figure 2 Optimization of induced expression and determination of expression form of ORF9 recombinant proteinM：三色预染蛋白Marker;1、6、13：阴性对照；5、12、19：空载体；2 4:分别在2 6、30、37 诱导的重组蛋白产物；7 11:IPTG浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmo l/L诱导的重组蛋白产物；14 18:诱导时间分别为1、2、3、4、5h的重组蛋白产物;2 0：沉淀中重组蛋白产物;2 1：上清中重组蛋白产物。M:Tri-color prestained protein Marker;1,6 and 13:Negative control;5,12 and 19:Empty vector;24:Products of the recombinant protein inducedat 26,30 and 37,r e s p e c t i v e l y;7 11:IPT G c o n c e n t r a t i o n s w e r e 0.1,0.5,1.0,1.5 a n d 2.0 mmo l/L i n d u c e d r e c o mb i n a n t p r o t e i n p r o d u c t s,r e s p e c-tively;1418:Recombinant protein products with induction time of 1,2,3,4 and 5 h,respectively;20:Recombinant protein products in precipita-tion;21:Recombinant protein products in supernatant.分析,结果显示,在洗脱液中存在较纯的、与预期大小（2 4.2 ku）一致的目的蛋白（图3），该蛋白经透析复性后，用BCA法测定其浓度为0.90 7 5mg/mL2.4重组纯化蛋白的Western-blot鉴定将纯化获得的ORF9重组蛋白，以小鼠抗6 His标签的抗体(1：40 0 0)为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（1：50 0 0）为二抗进行West-ern-blot鉴定。结果表明，得到了与预期大小一致的条带（2 4.2 ku）,表明该重组蛋白能被小鼠抗His标签抗体识别（图4）。2.5多克隆抗体效价测定以纯化后的ORF9重组蛋白为包被抗原，利用间接ELISA测定制备的多克隆抗体的效价，结果表明制备的小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体效价可达1:6 400。M1234567853ku40ku33ku25ku17ku10ku图3重组ORF9蛋白的纯化Figure 3 Purification of the recombinant ORF9 proteinM：三色预染蛋白Marker;1：菌体裂解上清；2：穿流液；3 4：变性裂解液；5 6：变性洗涤液；7 8：洗脱蛋白。M:Tri-color prestained protein Marker;1:Supernatant of bacteria ly-sis;2:Flow-through;3-4:Denaturing lysate;56.Denaturing deter-gent;7-8:Elution of protein.230第54卷中国兽医科学M1253ku40ku33ku25ku17ku10 ku图4纯化后重组ORF9蛋白的Western-blot鉴定Figure 4 Western-blot analysis of purified recombinant ORF9proteinM:三色预染蛋白Marker;l：纯化的重组ORF9蛋白；2:pET-32a（十）质粒对照。M:Tri-color prestained protein Marker;1:Purified recombinant ORF9protein;2:pET-32a(+)plasmid control.2.6Western-blot鉴定多克隆抗体以制备的小鼠血清为一抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，将前期制备的重组纯化蛋白经Western-blo鉴定，得到了与预期大小一致的条带（2 4.2 k u），结果显示该多抗可识别重组蛋白且特异性较好M1253ku40ku33ku25ku17 ku10ku图5ORF9蛋白多克隆抗体的Western-blot鉴定Figure 5Western-blot analysis of the ORF9 protein poly-clonal antibodyM：三色预染蛋白Marker;1：重组ORF9蛋白；2：重组PCV2Cap蛋白。M:Tri-color prestained protein Marker;1:Recombinant ORF9 protein;2:Recombinant PCV2 Cap protein.2.7IFA鉴定多克隆抗体PCV2感染PK15细胞后进行IFA，以制备的小鼠血清为一抗,FITC标记的山羊抗小鼠IgG为二抗。结果显示,该多抗能特异性识别被PCV2感染的PK15细胞中的ORF9蛋白,该蛋白主要位于细胞浆内。ABC图6 IFA鉴定抗ORF9蛋白多克隆抗体Figure 6 Identification of polyclonal antibody against ORF9protein by IFAA:IFA检测PCV2感染PK-15细胞中ORF9蛋白;B：空白PK-15细胞；C:PCV2ORF9的细胞定位。A:ORF9 protein in PCV2-infected PK-15 cells was detected by IFA;B:Blank PK-15cells;C:Cellular localization of PCV2 ORF9.3讨论PCV2是PCVAD主要病原体,该病毒优先靶向淋巴组织，导致猪淋巴组织损伤和免疫抑制，常与其他病原体造成混合感染 15,该病给世界养猪业造成了巨大的经济损失,疫苗接种是防控此病的有效方法 16 。虽然目前的疫苗足以预防临床疾病,但在PCV2的快速突变率、疫苗广泛普及和种猪频繁引进等情况下，可能无法提供保护，发生免疫失败的情况 5,这给防控带来了巨大的挑战。由于目前对PCV2如何通过其编码蛋白与宿主细胞的相互作用完成病毒的整个生命周期活动，以及PCV2编码蛋白对病毒复制和致病性的调控机制尚不完全清楚，对PCV2编码产物的鉴定和功能研究，可为理解PCV2病毒复制和发病机制提供理论依据。PCV2编码11个潜在的ORFs,其中只有7 个基因已被开展初步研究，其余几个ORFs是否存在还未见报道。关于PCV2基因组结构的认识还不足，对于编码蛋白功能的研究甚少，大部分基因功能仍然未知。本人通过前期试验发现PCV2感染PK15细胞后通过RT-qPCR可检测到ORF9mRNA的存在,通常PCV2编码蛋白经常规PCR检测以后，可进一步采用间接免疫荧光试验、Western-blot试验等方法来进行验证，但这些试验都需要特异性抗体，目前没有抗ORF9抗体可用。因此，针对ORF9蛋白制备特异性抗体对后续研究其生物学功能有重要意义。抗体可分为多克隆抗体和单克隆抗体，相较于单克隆抗体，多克隆抗体具有制备简单、生产成本231边孟婷等：猪圆环病毒2 型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备第2 期低、周期短、产量高，且能识别多个抗原表位及良好的特异性等优点，可满足基本试验需求 17 。原核生物大肠杆菌是目前用于异源表达重组蛋白的成熟表达系统，本试验采用了含硫氧还原蛋白融合标签的原核表达载体pET-32a（十）,其在被异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导后与大肠杆菌BL21(DE3)中的10 9aa TrxTag TM融合，可催化二硫键的形成，增强目的蛋白的可溶性 18-19。大量研究表明,原核表达蛋白内部信号肽结构可以提高蛋白的可溶性,但信号肽的存在并不确保重组蛋白有效分泌 2 0 ,ORF9蛋白经预测虽有信号肽结构，但在菌体破碎沉淀中表达量仍较高，说明其主要以包涵体的形式表达。本试验首先采用镍离子柱纯化以去除杂蛋白，利用浓度梯度尿素对包涵体进行溶解，降低蛋白的柔韧性，增强蛋白的溶解性，使重组蛋白复性。本研究通过原核表达系统获得了PCV2ORF9重组蛋白表达产物，对其诱导条件，如温度、IPTG浓度、诱导时间进行了优化,发现重组蛋白在IPTG浓度为0.1mmol/L、37 条件下诱导4h表达量最高。将纯化复性获得的重组ORF9蛋白，通过免疫BALB/c小鼠，成功制备了针对PCV2ORF9蛋白的小鼠多克隆抗体，经ELISA检测发现其效价可达1：6 40 0,W e s t e r n-b lo t 及IFA检测结果均显示该多克隆抗体具有良好的特异性，该多克隆抗体既能和原核表达的重组蛋白结合也能与被PCV2感染的PK15细胞中的天然蛋白结合，本研究为后续深人研究PCV2基因功能、感染机制及致病机理提供了可靠的材料基础。参考文献(References)1STEVENSON G W,KUPEL M,MITTAL S K,et al.Tissue dis-tribution and genetic typing of porcine circovirusesin pigs with naturally occuring congenital tremorsJ.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2001,13(1):57-62.2TISCHER I,RASCH R,TOCHTERMANN G.Characterizationof papovavirus-and picornavirus-like particlesin permanent pig kidney cell linesJ.Zentralblattfur Bakteriologie,Parasitenkunde,Infektionskran-kheiten und Hygiene.Erste Abteilung Originale.Reihe A:Medizinische Mikrobiologie und Parasito-1ogie,1974,226(2):153-167.3TISCHER I,GELDERBLOM H,VETTERMANN W,et al.A verysmall porcine virus with circular single-strandedDNAJJ.Nature,1982,295(5844):64-66.4ELLIS J,HASSARD L,CLARK E,et al.Isolation of cir-covirus from lesions of pigs with postweaning multi-systemic wasting syndromeJ.The Canadian veteri-nary journal,1998,39(1):44-51.5KARUPPANNAN A K,OPRIESSNIG 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