猪源大肠杆菌的耐药性与锌抗性相关性的研究.pdf
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1、第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202306013中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine猪源大肠杆菌的耐药性与锌抗性相关性的研究Vol.45,No.12Dec.2023任子宁,袁孝武,张烨淳,赖华敏,宋辉辉,俞道进”(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室,福建福州350 0 0 2)摘要:为了解猪源大肠杆菌的耐药性与大肠杆菌对重金属锌抗性的现状,探究耐药基因与锌抗性基因的流行特征及二者之间的相关性,本研究采集普通猪场
2、(A猪场)、从未使用过抗生素生长促进剂(AGP)的猪场(B猪场)以及未使用氧化锌和AGP的猪场(C猪场)共335份粪便样品,分离大肠杆菌,采用微量肉汤稀释法测定大肠杆菌分离株对10 种抗菌药物和硫酸锌的敏感性,并采用PCR检测分离菌的耐药基因和锌抗性基因。结果显示,在335份采集样品中共分离出2 8 8 株大肠杆菌。药敏试验结果显示,猪源大肠杆菌对四环素耐药的菌株数占比最高达95.83%(276/288),对呋喃妥因和多粘菌素B的耐药菌株占比最低,分别占7.9 9%(2 3/2 8 8)和12.15%(35/2 8 8),其中A猪场大肠杆菌分离株对10 种抗生素的耐药占比均高于B猪场。抗性基因
3、检测结果显示,锌抗性基因zitB检出率最高达9 9.6 5%,还检出了较高水平的锌抗性基因czcB、c z c A 及zntA;-内酰胺类耐药基因ampC检出率为9 8.2 6%,氯霉素类耐药基因cat1检出率仅为4.8 6%。其中A猪场与B猪场的4种锌抗性基因检出率均高于C猪场。相关性分析结果显示,锌抗性基因zntA、C z c A、c z c B对四环素类耐药基因tetA呈显著正相关(P0.05),与多粘菌素类耐药基因mcr-1呈极显著负相关(P0.01)。其中锌抗性基因zntA、c z c A 与耐药基因 cmlA、q n r s、n f s A 和nfsB均为极显著的正相关(P0.01
4、)。上述结果首次表明重金属锌可能诱导了动物肠道大肠杆菌的耐药性以及多重耐药表型,并且抗生素可能会影响猪大肠杆菌的锌抗性。本研究为后期养殖场抗生素及氧化锌的合理使用提供重要参考。关键词:猪源大肠杆菌;耐药性;耐药基因;锌抗性中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 2 3-0 9Study on correlation between antimicrobial resistance and zincresistance of porcine Escherichia coliREN Zi-ning,YUAN Xiao-wu,ZHAN
5、G Ye-chun,LAI Hua-min,SONG Hui-hui,YU Dao-jin*(University Key Laboratory for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicine and Animal Healthcarein Fujian Province,College of Animal Sciences(College of Bee Science),Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)Abstra
6、ct:In order to understand the antibiotic resistance of porcine E.coli and the status quo of E.coli resistance to heavymetal zinc,and explore the epidemic characteristics and correlation between resistance genes and zinc resistance genes.In thisstudy,a total of 335 fecal samples were collected from n
7、ormal pigs farm(A),pigs farms that had never used antibiotic growthpromoters(AGP)(B),and pigs farms that had not used zinc oxide and AGP(C).E.coli was isolated from feces.The sensitivityof E.coli isolates to 1o kinds of antibiotics and zinc sulfate was determined by microbroth dilution method,and th
8、e antibioticresistance genes and zinc resistance genes were detected by PCR.The results showed thata total of 288 E.coli strains were isolated*Corresponding author收稿日期:2 0 2 3-0 6-12基金项目:现代生猪产业技术体系岗位专家工作站-疾病防控岗位(KKE19011A)作者简介:任子宁(19 9 9-)),女,河北石家庄人,硕士研究生,主要从事细菌耐药性研究.*通信作者:E-mail:y u d a o j i n y e
9、 a h.n e t1224中国预防兽医学报2023年from 335 samples collected.The results of antimicrobial sensitivity showed that the antibiotic with the highest proportion ofantibiotic-resistant strains was tetracycline,accounting for 95.83%(276/288),and the proportion of resistance to NIT and PB wasthe lowest,they accou
10、nted for 7.99%(23/288)and 12.15%(35/288),respectively.The proportion of resistance of E.coli isolatesfrom farm A to 10 kinds of antibiotics was higher than that from pig farm B.The detection rate of zinc resistance gene zitB was99.65%,-lactam resistance gene ampC was 98.26%,and chloramphenicol resis
11、tance gene catl was only 4.86%.The detectionrates of four zinc resistance genes in farms A and B were higher than those in farms C.The results of correlation analysis showedthat zinc resistance genes zntA,czcA and czcB showed significantly positive correlation to tetA(P0.05),and significantlynegativ
12、e correlation to mcr-1(P0.01).The zinc resistance genes zntA and czcA were positively correlated with cmlA,qnrs,nfsAand nfsB(P0表示两者具有正相关性,R0表示两者呈负相关(P0.8表示两者高度相关。2结 果2.1纟细菌的分离鉴定对采集的335份粪便样品进行细菌的分离与鉴定,结果显示在伊红美蓝培养基上观察到湿润、紫黑色的大菌落,并具有典型的金属光泽(图1A)。利用特异性引物对疑似菌株进行PCR鉴定,结果共有2 8 8 个样品检测到约19 2 bp的目的条带,部分PCR结果
13、见图1B。根据PCR产物测序结果并经同源性分析后确定为大肠杆菌,分离率为85.97%(288/335),其中A猪场的分离率为9 5.2 1%(139/145),B猪场的分离率为9 8.46%(12 8/130),C猪场的分离率仅35%(2 1/6 0)(表2)。表明大肠杆菌分离率在不同猪场有差异。AB500bp250bp100bpA:伊红美蓝琼脂平板上形成的菌落形态;B:部分分离菌的PCR鉴定A:Colony formation on an eosin methylene blue AGAR plate;B:PCR identification of some isolates图1大肠杆菌的分
14、离及鉴定结果Fig.1E.coli isolation and identification results2.2分离菌药物敏感性试验对2 8 8 株大肠杆菌分离株进行10 种抗菌药物敏感性试验,结果显示,2 8 8株大肠杆菌对10 种抗菌药物均表现为不同程度的耐药,耐药比例最高的抗生素为四环素,占9 5.8 3%(276/288),其次是氨苄西林和氯霉素,分别占78.82%(227/288)和7 8.13%(2 2 5/2 8 8),对呋喃妥因和多粘菌素B耐药的菌株占比最低,分别占7.9 9%(23/288)和12.15%(35/2 8 8),而对头孢唑林、头孢噻、庆大霉素和环丙沙星均表现不
15、同程度耐药,并且发现不同采样点的大肠杆菌均对亚胺培南最敏感(表3)。但不同猪场分离的大肠杆菌的耐药率存在差异,A猪场的抗生素耐药菌株数均高于其他两个猪场,B猪场大肠杆菌耐药最低,C猪场大肠杆菌对氨西林、头孢唑林、亚胺培南的耐药比率均显著低于A猪场与B猪场。表明各猪场大肠杆菌均存在不同程度的耐药性。对2 8 8 株猪源性大肠杆菌分离株进行多重耐药性分析,结果显示,2 8 8 株猪源大肠杆菌多重耐药率为76.05%(219/288)。在多重耐药中主要以3、4、5重耐药为主,分别占19.10%(55/2 8 8)、15.9 7%(46/2 8 8)和13.19%(38/2 8 8)。其中6 株大肠杆
16、菌高达9 重耐药,有5株对10 种所检测的药物全部敏感。A猪场分离的大肠杆菌主要为6 和7 重耐药,各占15.8 3%(2 2/139)。而B猪场分离的大肠杆菌主要为3重和4重耐药,C猪场分离的大肠杆菌主要为3重和5重耐药(表4)。表明目前养猪场大肠杆菌多重耐药现象较严重。结合样品采集猪场的用药情况,上述研究结果表明,重金属锌可能对动物肠道内大肠杆菌的耐药性,以及多重耐药性的产生存在一定的诱导效应。表2 不同采样点大肠杆菌的分离结果Table 2E.coli isolation at different sampling sites采样点M1A猪场23一192bpB猪场4Sampling si
17、te母猪Sow仔猪Piglet保育猪Nursery pig中猪Middle pig大猪Big pig后备猪Replacement pig公猪Boar总Total2.3分离菌对硫酸锌的敏感性试验对2 8 8 株大肠杆菌进行硫酸锌敏感性试验,结果显示,大肠杆菌标准株ATCC25922对硫酸锌的MIC值为4 mmol/L。288株大肠杆菌分离株对硫酸锌的MIC值主要为2 mmol/L和4 mmol/L。其中A猪场保育猪分离的大肠杆菌对硫酸锌的MIC值为4 mmol/L8 m m o l/L,MIC值为4mmol/L的占8 0%,且有1株大肠杆菌对硫酸锌的MIC为2 mmol/L;C 猪场分离的大肠杆
18、菌对硫猪场Pig farm APig farm B34/3510/1035/4020/2015/1538/4015/1520/2014/1520/2015/1520/2010/10139/145Pig farm C21/60128/13021/60第12 期任子宁,等.猪源大肠杆菌耐药性与锌抗性相关性研究1227酸锌的MIC值为2 mmol/L6 m m o l/L,主要集中在4mmol/L,占52.38%;B猪场分离的大肠杆菌对硫酸锌的MIC值为1 mmol/L6 m m o l/L,其中MIC值2mmol/L的占比最高,达55.2 6%,且有1株大肠杆菌对硫酸锌的MIC值为1 mmol/L
19、(图2)。对保育猪而言,猪场A与猪场B分离的大肠杆菌对硫酸锌的MIC值差异极显著(P0.01)(图3)。本研究中B猪场仅分到3株对硫酸锌具有抗性的大肠杆菌,占2.34%,低于A猪场的9.35%结合A猪场和B猪场为正常添加含氧化锌饲料的猪场,但B猪场未添加抗生素的情况,表明抗生素的添加可能是保育猪粪便中大肠杆菌锌抗性的影响因素。表32 8 8 株大肠杆菌对10 种抗菌药物的耐药性Table 3Resistance of 288 E.coli strains to10 kinds of antibioticsNumber of drug-resistant bacteria/Proportion%
20、抗菌药物A猪场B猪场C猪场总计AntibioticTotalPig farm A Pig farm B Pig farm C(F-139)氨芋西林(AMP)116/83.45头孢唑林(CZO)91/65.47头孢噻(CTX)69/49.64四环素(TET)139/100.00庆大霉素(GM)78/56.12环丙沙星(CIP)60/43.17氯霉素(CHI)119/85.61呋喃妥因(NIT)6/4.32亚胺培南(IMP)4/1.20多粘菌素 B(PB)24/17.27表42 8 8 株大肠杆菌对10 种抗菌药物的多重耐药性Table 4Multi-drug resistance of 288
21、E.coli strains to10 kinds of antibiotics多重耐药菌株数/占比%耐药重数Number of multi-drug resistant bacteria/Proportion%DrugA猪场resistancePig farm Amultiple(IF-139)93/2.16815/10.79722/15.83622/15.83515/10.79419/13.67317/12.23221/15.1115/3.60002.4大肠杆菌耐药基因及锌抗性基因的PCR检测对2 8 8 株大肠杆菌分离株进行耐药基因及锌抗性基检出率为9 8.2 6%(2 8 3/2 8
22、8);仅有14株检出氯霉素类耐药基因cat1,检出率为4.8 6%(14/2 8 8)(表5)。本研究中A猪场大肠杆菌分离株的四环素耐药基因tetA和tetB的检出率,分别为8 3.45%(116/139)和30.2 2%(42/139),远高于C猪场大肠杆菌分离株对tetA(0)和tetB(4.76%,1/2 8 8)的检出率。A猪场和B猪场大肠杆菌分离株对nfsA和nfsB的检出率远高于C猪场,A猪场分离的大肠杆菌中oqxA的检出率也高于C猪场。C猪场分离的大肠杆菌中对mcr-1的检出率高达52.38%(11/2 1),远高于其他两个猪场(表5),这与其耐药表型相一致。表明猪群普遍存在锌抗
23、性基因,其耐药基因的不同可能和各猪场的锌用药情况有关。A10080%/uomuodold60%/1耐药菌株数/占比%(n-128)(n-21)96/75.0015/71.4351/39.847/33.3330/23.446/28.57116/90.6321/100.0017/13.288/38.103/2.345/23.8187/67.9719/90.485/3.9112/57.141/0.780/0.002/1.569/42.86B猪场C猪场Pig farm BPig farm C(n-128)(nF-21)1/0.782/9.52002/1.562/9.526/4.693/14.2918/
24、14.065/23.8125/19.532/9.5233/25.785/23.8126/20.312/9.5212/9.3805/3.910Pig farm APig farm Ba Pig farm C402051(n-288)0227/78.821149/51.74分离菌对硫酸锌的MIC值(mmol/L)105/36.46MIC value of zinc sulfate(mmol/L)276/95.83B100103/35.768068/23.61%/uomuodold%/1号225/78.1323/7.995/1.7435/12.15总计Total(n-288)6/2.0815/5.2
25、126/9.0331/10.7638/13.1946/15.9755/19.1049/17.0115/5.215/1.73260402050分离菌对硫酸锌MIC值(mmol/L)MIC value of zinc sulfate(mmol/L)图2288株大肠杆菌(A)和保育猪分离的大肠杆菌(B)对硫酸锌的敏感性Fig.2288 E.coli strains(A)and nursery swine E.coli(B)are sensitive to zinc sulfate10786420Pig farm A412646P0.01Pig farm 8口Pig farm APig farm Ba
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