第五章酶与细胞固定化关键技术.doc

第五章 酶与细胞固定化技术教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。教学办法：讲授教学手段：多媒体第一节 概述一、游离酶使用中局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差二、固定化酶研究克服游离酶缺陷办法之一50年代开始60年代后期，固定化技术迅速发展1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革三、基本概念1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）（Immobilized Enzyme) 指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。四、固定化酶长处增长了酶稳定性能减少酶总体费用酶分离和回收变得容易，并可重复使用使反映过程持续操作成为也许反映产物也易于提取纯化有助于过程设计和优化拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化办法一、酶固定化办法1、酶固定化办法（四大类办法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其他（酶逆胶束包囊法）一、酶固定化办法2、选取办法根据： 酶性质 载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等 制备办法简便易行 衡量根据： 测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率； 研究它最适反映条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； 稳定性和不稳定因素探究； 对酶进行人工修饰，使其与载体结合达到较为抱负构型和相容性。（一）吸附法1、原理：重要是运用细胞与载体之间吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，惯用吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可运用专一亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白与一甘露聚糖具备亲和力，而酿酒酵母细胞壁上具有一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了伴刀豆球蛋白上。2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上酶或酶系。 3、优缺陷：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体便宜易得，且可重复运用；缺陷是蛋白质与载体之间结合相称弱,并且诸多状况下,酶非特异性吸附经常会引起某些或所有失活,高浓度盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质脱附.因而当规定酶固定绝对牢固时,采用吸附法是很不可靠.4、惯用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最惯用吸附剂是离子互换剂羧甲基纤维素，DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖，合成阴离子和阳离子互换剂离子互换剂重要靠静电吸引，缺陷是当离子强度增长或介质pH、温度变化时，这种结合发生分解。5、举例：将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS中备用。（二） 包埋法1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定办法。 可分为凝胶包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。2、优缺陷：普通不需酶AA残基进行结合反映，很少变化酶高档构造，酶活回收率高；缺陷是包埋时发生化学聚合反映，酶易失活，须巧妙设计反映条件。此外网格构造影响底物和产物扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为变化，因此此法只适合于小分子底物和产物酶。3、海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒缺陷: 在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定. Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解长处: 海藻酸盐价格便宜 包埋条件温和4、角叉菜糖包埋法 K-角叉菜是一种具有许多硫酸根基团多糖化合物.在K+离子存在下，它能及时生成凝胶.缺陷: 对高浓度Na+离子敏感 固定化温度高,需要在3755 5、聚丙烯酰胺凝胶 在含酶(或细胞)水溶液中，加入一定比例单体丙烯酰胺和胶联剂N,N-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引起剂(过硫酸钾)作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶缺陷: 丙烯酰胺对酶具备变性作用6、聚乙烯醇（PVA）包埋法 磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法硼酸硬化法: 将聚乙烯醇在70 80进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中长处: 原材料价格便宜 条件温和 无毒害作用 循环冷冻法 硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1 界面沉淀法 运用某些高聚物在水相和有机相界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋。操作：酶液在油溶性表面活性剂存在下在水不互溶有机相中乳化形成油包水微滴，再将溶于有机溶剂高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂协助下由有机相移入水相。7、半透膜包埋法7.2界面聚合法 运用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原理包埋酶。例: 将含10%血红蛋白酶液与1，6己二胺水溶液混合，及时在含1%司盘-85氯仿-环己烷中分散乳化，再加入溶于有机相葵二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反映，形成尼龙膜，将酶包埋。（三） 交联法 基本原理：酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向交联网架构造，以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体氨基和酶蛋白中氨基交联形成席夫碱（基）Shiff 碱将酶固定化。含氨基载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，尚有乙撑二异氰酸酯OCN（CH2）6NCO。交联剂特点：带有二个以上功能基团。反映比较激烈条件比较严格。操作方便，活力回收不高。固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联系合物，第二步是迅速反映导致固化。交联法有5种形式：酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂浓度、溶液pH 和离子强度、温度和反映时间之间平衡。此法操作简朴，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺少选取性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高。酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增长蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最后浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，及时铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，经-30低温解决，再预热至4而得泡沫状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其她大孔型离子互换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。此法用于胞外酶固定化较好，特别是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体选取性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，并且酶分子仅存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载体自身有较好机械性能，因此产生固定化酶装柱流动性能好，缺陷是必要保证酶吸附在载体上。载体交联法：用多功能试剂一某些功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一某些功能基团偶连酶蛋白。也可运用多功能试剂一某些功能基团与一种聚合物单体反映，反映后再与酶一起共聚。交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细缺陷，同步制得固定化酶稳定性好戊二醛交联法缺陷： 双功能基团试剂与酶蛋白交联作用，常引起蛋白质高档构造变化，使酶失活。 为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交联酶蛋白溶液中添加一定量辅助蛋白。（四） 化学共价法1、概念所谓共价法就是使酶蛋白非必须基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通过共价键和不溶性载体形成不可逆联接。要使载体与酶形成共价键，必须一方面使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反映2、用于共价法固定酶蛋白上功能基团: 1）氨基-赖氨酸上-氨基以及多肽链N末端氨基酸上- 氨基； 2）羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上游离羧基,以及多肽链末端- 羧基; 3）酪氨酸上苯酚环; 4）半胱氨酸上巯基; 5）羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上羟基 6）组氨酸上咪唑基; 7）色氨酸上吲哚基其中以氨基和羧基为最惯用3、普通以为共价法特点如下： 酶和载体结合比较牢固，酶不易脱落。故使用半衰期较长。 制备条件复杂，反映激烈，易引起酶蛋白高档构造发生变化。 制备得到固定化酶，活力回收普通在50%左右。 载体不会引起蛋白质变性，经得起一定pH，浓度变化。4、惯用载体 天然高分子。如纤维素，葡聚糖凝胶（Sephadex），琼脂糖（Agarose Sepharose），卡那胶，淀粉以及它们衍生物。（运用-OH） 人工合成高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（运用-NH2） 无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。（要加上一种基团）5、技术要点 将所选用载体上关于基团活化，然后和酶蛋白上关于基团发生偶联反映。（直接活化或另接一反映基团） 在选用载体上接上一种双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。（接手臂）6、分类：重氮法； 叠氮法； 缩合法； 烷化反映法； 硅烷化反映法；溴化氰法。 重氮法当前在咱们国内用较多载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，用这些载体制备了不少固定化酶。办法原理如下： 用双功能试剂 - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），连接于被活化（-OH）纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。 在盐酸和亚硝酸钠解决下把ABSE-纤维素变成重氮盐。 把酶偶联于ABSE-纤维素上 叠氮法是在酶分子与载体间形成肽键固定化办法。重要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态衍生物，然后与酶游离氨基反映，从而形成肽键。例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，环节如下： 酯化：CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl 气体，进行酯化反映；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥。 肼解:把酯化后CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反映1 小时，过滤，甲醇洗涤干燥。 叠氮化:肼解后CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl 在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2 反映20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同步加酶，防止戊二醛另一醛再与载体上另一种-NH2 反映。(4) 偶联：经叠氮化后载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg 酶），5搅拌2-3 小时，过滤用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存） 缩合法（对含-NH2,-COOH 载体另一种办法）重要运用品有羧基或氨基载体，加入到酶液中，在缩合剂碳化二亚胺（双环己基碳酰胺）作用下，使载体羧基或氨基和酶蛋白上NH2 或 COOH 形成肽链而被固定。含羧基载体有羧甲基纤维素，羧甲基交联葡聚糖等。含氨基载体有氨乙基纤维素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。 烷基化反映法。将具有卤素官能团试剂与非水溶性纤维素载体进行烷化反映，然后和酶进行偶联制得固定化酶。普通惯用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。 硅烷化法：多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。普通惯用载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。这些多孔玻璃孔径在2501000 埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1 克所拥有表面积达100 平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热解决原子重组而成，是优良载体，但必要加以改造）。本法进行酶固定化可分三个环节： 将本体接上一种结合剂（也即硅烷化）； 接上功能基团； 把酶共价结合于载体。 溴化氰法-异脲键合法本办法重要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体占多数（大孔网状构造）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到固定化酶当前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好性能。上述这些载体在高pH 条件下（pH11 左右），溴化氰和多糖一类物质形成一种环化活泼亚氨碳酸盐，该化合物对蛋白质上NH2 反映十分敏感，生成N-取代异脲，N-取代亚氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中重要产物为N-取代异脲，反映式如右：例：胰蛋白酶固定-均在4时进行。 活化：称取琼脂糖凝胶100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl 和H2O 洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按1ml 沉淀凝胶加入50300mgCNBr。及时用2N NaOH 调pH 值1011，维持pH 值11，pH 值不再下降，直到反映终结。反映在25通风橱内进行，反映仅需10 分钟，这样CNBr 将载体所有活化，生成活泼亚氨碳酸盐。反映完毕后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCO3 洗涤（注意：切忌用带有-NH2 基缓冲液来洗涤，由于亚氨碳酸盐对NH2-敏感，在酶偶联时，活性部位被NH2 占领，酶偶联不上），去除多余CNBr 和杂蛋白。 偶联：用偶联缓冲液（0.025M pH 10.2 硼酸缓冲液-0.02M CaCl2 或NaHCO3 平衡洗涤，抽干，加入5ml 缓冲液（内含16mg 酶）温度降至4，搅拌反映4 小时，最后分别用0.1M pH8.5 硼酸缓冲液-1M NaCl 洗涤即成10.2M pH 4.0 醋酸缓冲液去除各种杂质第三节 细胞固定化办法一、吸附法同酶办法，（1）酵母细胞带负电荷，在pH3-5条件下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体表面，制成固定化细胞（2）霉菌菌丝可吸附在多孔塑料、金属丝网等载体上来固定化（3）植物细胞可吸附在中空纤维外壁上固定化（4）动物细胞大多具备附壁生长特性，须依附在固体表面才干生长，可吸附在容器壁，微载体（颗粒细小载体，直径100-200um）和中空纤维外壁等载体上来固定（培养液在中空纤维内流动）。二、包埋法同酶包埋法例：海藻酸钙-聚赖氨酸（ALG-PLL）包埋技术 动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋聚赖氨酸解决，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜柠檬酸钠溶液解决，使海藻酸钙凝胶溶解聚赖氨酸膜包被近乎透明微囊型固定化 动物细胞。三、原生质体固定化可解决胞内酶生产利于氧传递，营养成分吸取普通采用凝胶包埋法涉及原生质体制备和固定两个环节1 原生质体制备规定：保持膜完整性，不能使细胞内部构造遭到破坏制备：对数期细胞收集高渗溶液中加酶破壁分离除去细胞碎片、完整细胞及酶（密度梯度离心）原生质体2 原生质体固定原生质体等渗缓冲液中配成一定浓度原生质体悬浮液凝胶包埋角叉菜胶固定化 含渗入压稳定剂缓冲液与角叉菜加热溶解配成3%-8%凝胶灭菌冷却到50左右与等体积原生质体悬浮液混合均匀滴入到一定浓度预冷氯化钾溶液中球状固定化原生质体2 原生质体固定光交联树脂固定化法用具有渗入压稳定剂缓冲液配制30%-60%浓度光交联树脂预聚体，加热溶解后，在50左右，加入1%光敏剂，与等体积原生质体悬浮液混合均匀，摊成薄层，经紫外光照射2-3mm，聚合后切成一定形状小块，制成片状固定化原生质体。第四节 固定化酶评价一、相对酶活力 具备相似酶蛋白量固定化酶与游离酶活力比值称为相对酶活力,它与载体体构造、颗粒大小、底物分子量大小及酶结合效率关于。相对酶活力低于75%固定化酶,普通没有实际应用价值。二、酶活力固定化单位定义为：转化底物量/固定化酶单位重量（单位面积）/单位时间,单位是：mol/mg(cm2)/min。将酶进行固定化时,总有一某些酶没有与载体结合在一起,测定酶活力回收率可以拟定固定化效果。活力回收=固定化酶总活力/被固定化游离酶总活力100%，或称偶联效率、活力保存百分数。普通状况下,活力回收率应不大于1,若不不大于1,也许由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除成果。三、固定化酶半衰期 即固定化酶活力下降为初始活力一半所经历时间。它是衡量固定化酶操作稳定性核心，其测定办法与化工催化剂半衰期测定办法相似,也可以通过长期实际操作,也可以通过较短时间操作来推算。 第五节 固定化酶性质一、酶活力变化 固定化酶活力在多数状况下比天然酶活力低，专一性也也许发生变化，其因素也许是：酶构象变化导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力变化；载体存在给酶活性部位或调节部位导致某种空间障碍，影响酶与底物或其她效应物作用；底物和酶作用受其扩散速率限制。在个别状况下，固定化酶由于抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。二、酶稳定性提高酶稳定性涉及热稳定性、对各种有机试剂稳定性、对pH稳定性、对蛋白水解酶抗性及储存稳定性等。三、最适pH值变化 酶固定化后，催化底物最适pH值和pH活性曲线常发生变化，引起变化因素重要有两个1、载体带电性质：载体带负电荷时，会吸引反映液中H+，致使酶附近反映区域pH比周边反映液低，须提高反映液pH；反之，减少反映液pH。第五节 固定化酶性质2、产物性质：由于载体扩散障碍，产物为酸性时，产物积累在固定化酶所处催化区域内，使此区域pH减少，须提高须提高周边反映液pH；反之，减少周边反映液pH。四、最适温度变化 普通状况下，固定化后酶最适作用温度与游离酶差别不大，但有时由于固定化办法和载体影响，固定化酶最适作用温度也许减少，也也许升高，须加以注意，最适温度提高是有利，可以减少酶失活速率。五、动力学常数变化(随载体性质变化)：由于分派效应：=Si微环境/S宏观环境对简朴固定化酶系统，其动力学性质普通服从米氏方程： 载体与底物带相似电荷，SiS,则Km 固定化酶减少了酶亲和力。 载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，1,KmKm六、底物特异性：对于作用于小分子底物酶，变化不明显；但对于可作用于小分子底物又可作用于大分子底物酶来说，由于载体空间位阻作用，大分子底物难以接近酶分子而使催化速度大大减少，如固定在羧甲基纤维素上胰蛋白酶，对二肽或多肽作用保持不变，对酪蛋白作用仅为游离酶3% 左右。第六节 固定化辅酶一、辅酶固定化意义辅酶类物质是某些“全酶”构成成分，参加催化反映。同步当其与某些高分子物质结合时，可以大大提高催化效率。因而，将其固定化，一方面是固定化酶必须，另一方面，固定化酶可以提供亲和色谱吸附剂。此外，还也许为研制“人工酶”提供实验模型，甚至可以将某些酶催化性质加以变化，例如变化其底物特异性和热稳定性。辅酶物质固定化普通采用共价偶联法，或将其进行恰当化学修饰后进行包埋。酶惯用固定化载体，有琼脂糖、纤维素、合成高分子材料及微孔玻璃等不溶性物质；也有用葡聚糖、聚氨基酸或聚乙烯胺等不溶性材料，尚有用海藻酸。固定化反映惯用重氮化反映，卤代烷基化反映和BrCN反映等。二、按作用机理可将辅酶提成二大类 辅基型辅酶（酶内传递）：它与酶结合牢固，难以解离，是酶活性中心构成某些，在反映终结时再生成原形。 底物型辅酶（酶间载体）：它与酶结合不牢固，容易解离，在酶反映中它由酶从底物AX 接受还原单位或化学基团X，转移到酶，然后将X 传递给底物B 后再生成原形。因而，可将它看作是一种特殊共同底物。三、需辅酶酶亲和固定化需辅酶酶，其酶蛋白和辅酶之间，有较强亲和力，因而此类酶固定化，可以用溴化氰活化法或重氮化法或烷基化法，直接将酶蛋白共价结合于载体。为维持正常催化作用，必须不断向反映系统补充辅酶，另一种办法是将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附上去。四、保存辅因子办法1、在系统中不断加入辅因子2、固定化增殖细胞加入法3、固定化酶辅因子办法4、加入辅因子共价结合法。附：固定化酶与生物传感器 近年来，生物传感器发展非常迅速，它是用生物活性物质作敏感器件，配以恰当换能器所构成分析工具可分为：酶传感器，微生物传感器，免疫传感器，场效应晶体管传感器。 酶传感器是间接型传感器，运用酶催化作用，在常温、常压下将各类生物分子氧化或分解，然后通过测定与反映关于物质浓度，进而换算成相应物质浓度。当前，国际上已研制成功酶传感器有几十种，其中最为成熟是葡萄糖传感器。第五章 习题1、固定化酶、固定化细胞（原生质体）2、酶固定化办法有哪些？3、为什么要进行原生质体固定化？4、界面沉淀法和界面聚合法 固定化酶原理。5、举例阐明酶传感器工作原理？6、评价固定化酶指标有哪些？7、简述固定化酶性质。