黑龙江省哈尔滨市苜蓿镰孢根腐病病原菌分离鉴定_朱月.pdf

第 43 卷 第 2 期草 原 与 草 坪 2023 年黑龙江省哈尔滨市苜蓿镰孢根腐病病原菌分离鉴定朱月，任乃芃，唐佳琳，刘香萍*（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）摘要：【目的】明确黑龙江省哈尔滨市苜蓿根腐病病原菌种类。【方法】采集 38株黑龙江省哈尔滨市农业科学院示范区的苜蓿根腐病病株，经组织分离法分离致病菌，通过科赫氏法则验证其致病性并结合形态学和 rDNA-ITS序列分析鉴定病原菌。【结果】从患有苜蓿根腐病的病根分离并选取具有代表性的 5 株真菌 KY1、J1、S1、SA1、C1，分别被鉴定为腐皮镰孢（Fusarium solani）、尖镰孢（F.oxysporum）、水稻恶苗病菌（F.fujikuroi）、三线镰孢（F.tricinctum）和层出镰孢（Fusariumproliferatum）。致病性测定表明 5株真菌均为苜蓿根腐病致病菌。【结论】腐皮镰孢不仅分离率最高，为 57.45%，且致病性也较强，病情指数为 61.00，是优势病原菌。关键词：苜蓿；根腐病；腐皮镰孢；鉴定；致病性中图分类号：S541+.1 文献标志码：A 文章编号：1009-5500（2023）02-0099-08 DOI：10.13817/ki.cyycp.2023.02.012紫花苜蓿（Medicago sativa）是优质多年生豆科牧草，在世界范围内栽培最早、分布面积最广，适应性强，营养价值高，有“牧草之王”的美誉1-3。苜蓿作为我国主要优质牧草之一，对畜牧业发展尤为重要4-5。近年来，国内苜蓿在所有栽培牧草中的地位日渐凸显，其种植面积逐渐扩大6。随着苜蓿集约化程度不断提高，苜蓿病害的发生日趋严重4-5，其中根腐病已成为苜蓿单产下降和植株衰败的一个极其重要的因素7-8，该病一旦大面积发生会严重降低苜蓿产量，甚至需要重新建植，严重阻碍苜蓿大面积推广9。根腐病是世界性病害，在国内外的各个苜蓿栽培区普遍发生，全世界每年由根腐病造成的产量损失在 20%左右，有些发生严重的地块甚至达到 40%10-12。我国自1991 年发现苜蓿根腐病害以来，先后在新疆13、甘肃14、青海13、四川15、内蒙古16等地都有陆续报道。苜蓿根腐病在美国，加拿大、澳大利亚、俄罗斯、日本和阿根廷等16-21国家也发生严重。经大量研究发现，引起苜蓿根腐病的病原菌种类繁多22-25，如真菌、细菌和线虫均可导致苜蓿根腐病的发生。据报道引起我国苜蓿病害的病原有 38 种真菌，其中根腐病病原有 23 种，分为镰孢菌（Fusarium spp）、丝 核 菌（Rhizoctonia spp.）、腐 霉（Pythiaceae spp.）、疫霉（Phytophthora spp.）24，26，镰孢菌为导致根腐病的重要优势病原菌27，极具研究价值。但镰孢菌在真菌中具有一定的特殊性，因其形态相似且易受地区和环境的影响而存在差异，所以研究结果不尽相同8，25，27-29。1999 年陈雅君等26对黑龙江省 8 个地区紫花苜蓿种植区进行了根腐病的调查研究，结果表明，优势致病菌为镰孢菌、丝核菌。明确不同生态环境下苜蓿根腐病病原菌的种类和优势致病菌对苜蓿根腐病的防治尤为重要，目前，笔者对黑龙江省哈尔滨市的多个苜蓿种植基地进行调查，发现根腐病为苜蓿田间危害较为严重的病害之一，危害严重的地块发病率可达 70%以上。因此，本研究对该地苜蓿根腐病收稿日期：2022-02-16；修回日期：2022-03-21基金项目：黑 龙 江 省 科 技 计 划 省 院 科 技 合 作 项 目（YS20B10）；黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2021-Y01）；黑龙江八一农垦大学学成、引进人才科研启动计划（XDB2014-05）、大庆市新能源领域“揭榜挂帅”科技攻关项目（2021BD05）作者简介：朱月（1998-），女，河南省淮阳人。E-mail：*通信作者。E-mail：99GRASSLAND AND TURF（2023）Vol.43 No.2 的致病菌进行分离、鉴定及致病性测定，以期为该病的综合防治及抗性育种提供理论基础。1材料和方法1.1材料的来源与准备2019 年 7 月 10 日在黑龙江省农科院国家现代农业示范区采集发病苜蓿病株 38株，带回实验室进一步分离鉴定，并对田间患有根腐病的植株根部进行观察拍照（图 1）。供试苜蓿品种为驯鹿，种子来源于克劳沃（北京）生态科技有限公司。1.2病原菌的分离纯化将采集来的 38株苜蓿病根洗净后晾干，于根部病健交界处剪成 5 mm5 mm 的小块组织，用 1%次氯酸钠处理 30 s，无菌水冲洗 35 次；接种在 PDA 培养基 平 板 上，培 养 基 中 加 入 配 制 好 的 链 霉 素 溶 液（50 mg/mL）以防细菌感染。把处理过的病块组织放在 PDA 培养基上 25 暗培养 23 d，挑取组织块周围长 出 不 同 形 态 的 菌 丝 于 MGA 培 养 基（蛋 白 胨15 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、结晶硫酸镁 0.5 g/L、孔雀石绿 2.5 mg/L、琼脂粉 20 g/L、无菌水至 1 L，MGA培养基可减少细菌污染且有利于大小孢子产生）3 次转接纯化后，待菌丝产孢后制成孢子悬液，浓度稀释至40倍物镜下每个视野 12个孢子，在超净工作台中将水琼脂（琼脂粉 20 g/L）切成 5.0 cm1.5 cm 的长方形，放在灭菌的载玻片上，用无菌的三角玻璃棒蘸取适量孢子悬液，均匀涂抹在水琼脂上，25 暗处理1012 h 后，在显微镜下将长出芽管的孢子移入新的MGA 培养基上培养，获得病原菌的单孢纯化菌株，将纯化得到的菌株保存待用。1.3致病性鉴定将接种在 PDA 液体培养基中的代表性菌株的菌丝体放入摇床上（180 r/min，25），在黑暗条件下培养 10 d，用无菌漏斗加无菌棉花过滤，制备成孢子悬液（孢子浓度 1106个孢子/mL），摇匀后立即使用。挑选外观健康、外形相同或相近的种子，在无菌的条件下将种子在 75%酒精中灭菌 2 min，然后在 1%次氯酸钠中消毒 5 min，用无菌水冲洗 35次，并用无菌滤纸吸干种子表面的水分，倒入底部铺有两层滤纸的无菌培养皿内，在培养皿中加入无菌水进行催芽。待种子发芽后挑选长势一致的幼芽均匀的摆放在培养皿中，每皿 20粒，每种分离物分成 2组，一组作为处理组，另一组作为对照组，设 3个重复。处理组每皿用移液枪注入 3 mL 孢子悬液，对照组每皿注入 3 mL 无菌水，放入（251）恒温培养箱中暗培养，每日补充无菌水。待苜蓿幼芽充分表现病症后（约 14 d），测定幼芽的发病株数和发病程度，并从根部病健交界处重新进行病原菌分离。苜蓿幼芽的病情分级标准根据以下标准进行统计：0 无明显病症；根部变细，根部病斑面积小于全根面积 5%；根部出现病斑且占全根面积 5%20%；.根部出现病斑占全根面积 20%50%；根部病斑占根面积 50%100%。用以下公式计算发病率和病情指数：发病率（Disease incidence，DI）=根部变色植株数/调查总株数100%病情指数（Disease severity index，DSI）=(各级株数 相应发病级别)总株数 最高发病级别 100%采用 Excel 2010 进行数据录入，利用 SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析，处理间采用 Duncan s 法进行多重比较，统计检验的显著水平以 P0.05为基准。1.4病原菌形态学鉴定25 暗培养 5 d后，观察菌落的生长状况如颜色、菌丝的疏密程度和形状的变化，对是否有凸起进行记录，并测量菌落在 MGA 培养基上的直径（采用十字交叉法）；然后挑取菌丝制成水装片，在光学显微镜下观察病原菌的形态特征并进行拍照记录。图 1紫花苜蓿镰刀菌根腐病病根Fig.1The root of Fusarium root rot in alfalfa注：A、B为感染根腐病菌的苜蓿根部100第 43 卷 第 2 期草 原 与 草 坪 2023 年1.5分子生物学鉴定在分离纯化后的 MGA培养基上打 5个菌饼，放入PDA 液体培养基中，25 震荡 45 d，过滤出菌丝体并用真空泵抽干水分，采用真菌基因组 DNA 提取试剂盒（购买于 OMEGA公司）进行 DNA提取。采用真菌通用引物 ITS1（5 TCCGTAGGTGA ACCTGCGG3）和 ITS4（5 TCCTCCGCTTATT GATATGC3）进行 PCR 扩增，PCR 扩增反应体系为 25 L，包括 2 power Taq PCR masterMix 12.5 L、ITS1（10 mol/L）0.3 L、ITS4（10 mol/L）0.3 L、DNA 模板（10 ng/L）3 L、ddH2O 8.9 L。扩增的程序为：94 预变性 3 h，94 变性 30 min，56 退火 30 min，72 延伸 1 h，共 35 个循环；最后72 延伸 10 min；PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳确认有条带后送往上海生工生物工程有限公司进行测序。在数据库 NCBI 中进行 BLAST 分析，登录 GenBank 数据库（http：/www.ncbi.nim.nih.gov/blast），将所得到的序列进行相似性对比，记录比对结果，通过 MAGA7.0构建分子发育树。2结果与分析2.1病原菌的分离纯化从 38 个供试苜蓿根部中分离出 47 株镰孢菌，从菌落形态、大小孢子形态及厚垣孢子有无等形态特征将分离获得的分离物分为 5 类，每类镰孢菌分别选择其中具有代表性的菌株各 1 株，分别命名为 KY1、J1、S1、SA1和 C1。2.2分离物的致病性测定通过幼芽回接试验，各代表性菌株接种幼根均可致苜蓿发病，但 5 个株系发病率差异均不显著（表 1）。其中 S1的致病性较强（P0.05），发病率为 94.00%，病 情 指 数 为 91.50；J1 致 病 性 最 弱，发 病 率 为100.00%，病情指数为 42.50。C1、SA1 和 KY1 的发病率分别为 98.00%、100.00%和 96.00%；病情指数分别为 49.00、85.50 和 61.00。将发病根部进行病原菌再分离，并与初接菌做对比，发现再分离菌与初接菌为同一种菌，符合柯赫氏法则；因此，KY1、J1、S1、SA1和 C1为苜蓿根腐病的致病菌。2.3病原菌的形态学鉴定KY1、J1、S1、SA1 和 C1 菌株根据 MGA 培养基上的形态特征，进行了初步鉴定。2.3.1KY1菌株的形态特征在 MGA 培养基上，气生菌丝稀松为白色，丝绒状或棉絮状菌落，菌落圆形边缘整齐，25 培养 5 d后，菌落直径 4.75.0 cm，生长 速 率 0.780.84 cm/d，小 型 分 生 孢 子 大 小（819）m（37）m，多数为卵圆形、椭圆形、肾形；大型分生孢子大小（3549）m（37）m，分生孢子呈镰刀形、月牙形（图 2），该菌株初步鉴定为腐皮镰孢（F.solani）。表 1不同病原分离物的致病性Table 1Pathogenicity of different pathogen isolates株系KY1J1S1SA1C1发病率/%96.000.04a100.000.00a94.000.06a100.000.00a98.000.02a病情指数/%61.000.04bc42.500.05c91.500.08a85.500.21ab49.000.03c注：同列不同小写字母表示差异显著（P50%）103GRASSLAND AND TURF（2023）Vol.43 No.2 为 8.51%；三线镰孢含 SA1 等 3 株，层出镰孢含 C1 等3株，二者均占总数的 6.38%。3讨论本研究从苜蓿根腐病病株中分离并选取 5株具有代表性的真菌 KY1、J1、S1、SA1 和 C1，经鉴定分别为腐皮镰孢（F.solani）、尖镰孢（F.oxysporum）、水稻恶苗病菌（F.fujikuroi）、三线镰孢（F.tricinctum）和层出镰孢（F.proliferatum）。仅通过形态学鉴定镰孢菌具有一定的难度和不确定性，采用分子生物学鉴定可以弥补传统分类鉴定方法中的不足，对病原菌进行快速准 确 的 鉴 定30。rDNA ITS 介 于 18S rDNA、5.8S rDNA 和 28S rDNA 之间的区域，该区域进化速度较编码区块，被普遍用来进行真菌种间或种内的遗传相似性的分子系统研究31-33。本研究采用形态学与rDNAITS 序列分析相结合的方法进行鉴定，可以对形态学鉴定的不足之处进行补充和查漏，从而避免了因种间高度的相似而带来的鉴定错误。但 ITS 对亲缘关系较近的种分辨率不够高，而 EF-1 则可以较好地表现镰孢菌在种一级的关系34，具有更高的分辨能力，更适合作为系统进化研究的遗传标记。在今后镰孢菌鉴定中可采用该方法，为该病害研究提供科学依据。丛丽丽等8采用 rDNAITS 和 TEF1 序列对镰孢菌菌种鉴定，增加鉴定结果的准确性。本研究表明镰孢菌的 5 个种对苜蓿均具有致病性，但不同菌株之间致病能力差异明显，其中水稻恶苗病菌对苜蓿致病力最强，发病率为 94.00%，病情指数为 91.50，是引起哈尔滨市苜蓿镰刀菌根腐病的主要致病菌；水稻恶苗病菌是引起水稻恶苗病的主要致病菌35；这与本研究结果一致。Li36研究表明麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）是引起哈尔滨市苜蓿根腐病的病原。杨剑锋等37研究表明变红镰孢菌是引起呼和浩特市苜蓿根腐病的优势致病种。这表明地域环境、生态条件、土壤类型和种植结构等因素不同，苜蓿根腐病的发病程度和病原菌群体结构组成也存在较大差异37-38。三线镰孢和腐皮镰孢对苜蓿致病力较强，发病率分别为 100%和 96.00%，病情指数分别为 85.50 和 61.00，原因可能是：大量病原菌丝堆积在植物内表皮层细胞壁和质膜上形成凸起结构，使植物细胞内部通透性变小导致植物细胞完整性被破坏，从而影响植株水分和营养物质运输39。腐皮镰孢为多种植物根腐病的优势病原，但其致病力相对中等30，40。层出镰孢和尖镰孢对苜蓿致病力较弱，发病 率 分 别 为 98.00%和 100.00%，病 情 指 数 分 别 为49.00和 42.50，层出镰孢多认为其致病力较弱或无致病性8；但张静妮等41研究表明尖镰孢是引起内蒙古西部地区苜蓿根腐病的优势病原菌且致病性最强。原因可能是：在不同地域环境和生态条件下尖镰孢需要其它镰孢菌复合侵染才能致病或提高致病力。根腐病广泛发生在大豆、燕麦、马铃薯、番茄和草莓等42-45植物上，严重影响其质量和产量，因此根腐病的防治尤为重要，目前该病害的防治方法多种，农业措施、化学防治和品种抗病性研究最为普遍。今后研究，应着重筛选和培育抗病品种，本研究为后续苜蓿根腐病防治研究奠定了基础。4结论本研究结合形态学和分子生物学鉴定，共分离获得 47个菌株，分别属于腐皮镰孢（F.solani）、水稻恶苗病菌（F.fujikuroi）、尖镰孢（F.oxysporum）、三线镰孢（F.tricinctum）和层出镰孢（F.proliferatum）5 个种。其中腐皮镰孢分离率最高，是采样区优势致病菌。此外，5种真菌均能使苜蓿致病。参考文献：1 赵美荣，申玉华，李永春，等.紫花苜蓿抗逆基因工程研究进展 J.草地学报，2014，22（2）：243-248.2 Wang S R，Wang Y，Shen L，et al.The cultivation technique and utilization of Medicago sativa L.J.Forest Investigation Design，2012（4）：93-95.3 Hill Jr R R，Shenk J S，Barnes R F.Breeding for yield and qualityJ.Alfalfa and alfalfa improvement，1988，29：图 95种镰孢菌菌种的分离率Fig.9Isolation rate of 5 species104第 43 卷 第 2 期草 原 与 草 坪 2023 年809-825.4 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isolated by tissue separation method，verified by Kochs rule and identified by morphology and rDNAITS sequence analysis.【Result】The five representative fungal strains，KY1，J1，S1，SA1 and C1，were isolated and selected from alfalfa roots and identified as F.solani，F.oxysporum，F.fujikuroi，F.tricinctum and F.proliferatum，respectively.The pathogenicity test showed that all the five fungi were pathogenicfor alfalfa root rot.【Conclusion】F.solani not only had the highest isolation rate（57.45%），but also had strong pathogenicity，with a disease index of 61.00，which was the dominant pathogen.The alfalfa root rot caused by F.fujikuroi was reported for the first time in China.Key words：alfalfa；root rot；Fusarium solani；identification；pathogenic106