豆豉与淡豆豉的成分测试及微生物菌群分析_董超.pdf
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1、第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:河北省科学院科技计划项目(23304)、河北省自然科学基金项目(H2022423341)Fund:Supported by the Science and Technology Program of Hebei Academy of Sciences(23304),and the Natural Science Foundation of Hebei Province(H20224
2、23341)*通信作者:董超,正高级工程师,主要研究方向为药物和食品微生物发酵及开发。E-mail:*Corresponding author:DONG Chao,Professor,No.46,Youyi South Street,Shijiazhuang,Hebei 050081,China.E-mail: 豆豉与淡豆豉的成分测试及微生物菌群分析 董 超1*,孙劲冲1,李若楠1,薛 正1,王鑫国2(1.河北省科学院生物研究所,石家庄 050081;2.河北中医学院药学院,石家庄 050091)摘摘 要要:目的目的 测试食品豆豉和中药淡豆豉样本中的药典成分,分离培养其留存的微生物菌株,分析微
3、生物类别、发酵过程与功能成分的关系。方法方法 平板筛选培养、菌苔外观和显微镜鉴别微生物菌株,液相色谱法测定大豆异黄酮及苷元成分的含量,纤维平板法测试纤溶酶活性。结果结果 中药淡豆豉和食品豆豉的微生物以枯草芽孢杆菌最多,其次是霉菌和酵母;样本大豆异黄酮和苷元成分差异较大,有些中药材淡豆豉低于药典标准;个别食品豆豉样本具有纤溶酶活性,中药材淡豆豉少有纤溶酶活性。结论结论 留存于淡豆豉或豆豉中的微生物丰度顺序如下:枯草芽孢杆菌、霉菌和酵母;大豆异黄酮和苷元成分的含量与发酵过程有关,样本的差异较大;溶栓不是中药材淡豆豉的主要功效。关键词关键词:淡豆豉;豆豉;大豆异黄酮;微生物菌群 Ingredient
4、 test and microbial flora analysis of the Fermented Soya Bean and Sojae Semen Praeparatum DONG Chao1*,SUN Jin-Chong1,LI Ruo-Nan1,XUE Zheng1,WANG Xin-Guo2(1.Institute of Hebei Biology,Shijiazhuang 050081,China;2.Pharmacy College of Hebei Chinese Medicine University,Shijiazhuang 050091,China)ABSTRACT:
5、Objective To test the pharmacopoeia components in the samples of food Fermented Soya Bean and Chinese medicine Sojae Semen Praeparatum,isolate and culture the remaining microbial strains,and analyze the relationship between microbial types,fermentation process and functional components.Methods The m
6、icrobial strains were identified by plate screening culture,fungus appearance and microscope.The content of soybean isoflavones and aglycones were determined by liquid chromatography,and the fibrinolytic enzyme activity was tested by fiber plate method.Results Bacillus subtilis was the most microorg
7、anism in traditional Chinese medicine Sojae Semen Praeparatum and food Fermented Soya Bean,followed by mold and yeast.The components of isoflavones and aglycones in the samples were quite different,and some Chinese medicine Sojae Semen Praeparatum were lower than the pharmacopoeia standard;individua
8、l food Fermented Soya Bean samples had fibrinolytic enzyme activity,while traditional Chinese medicine Sojae Semen Praeparatum had little fibrinolytic enzyme activity.Conclusion The order of microbial abundance in Sojae Semen Praeparatum or Fermented Soya Bean is as follows:Bacillus subtilis,mold an
9、d yeast;the content of soybean isoflavone and aglycone are related to the fermentation process,and the samples are quite different.Dissolving thrombus is not the main effect of Chinese medicine Sojae Semen Praeparatum.KEY WORDS:Sojae Semen Praeparatum;Fermented Soya Bean;soybean isoflavone;microbial
10、 flora DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.016第 11 期 董 超,等:豆豉与淡豆豉的成分测试及微生物菌群分析 155 0 引 言 淡豆豉是指豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的干燥成熟种子(黑豆)的发酵加工品,其味苦辛、性凉,归肺胃经,具有解表、除烦、宣发郁热的功效,用于治疗感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠等症1。淡豆豉中的异黄酮类、苯丙素类、氨基酸类、核苷类等活性成分有抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、抗骨质疏松、降糖等药理作用24,部分豆豉或淡豆豉被检测到纤溶酶活性,具有类似日本纳豆溶解血栓的效果。豆豉是中国最古老的发酵食品
11、之一,其记载最早见于楚辞的“大苦咸酸”5。中药淡豆豉是豆豉发展到一定阶段后的细分品类,具有药食同源的同根性。贾思勰的齐民要术对豆豉的制作过程描述最详细6,淡豆豉的炮制工艺以李时珍的本草纲目为遵从标准7,2020 年版中国药典中淡豆豉的制法如下:取桑叶、青蒿各70100 g,加水煎煮,滤过,煎液拌入净大豆 1000 g 中,俟吸尽后,蒸透,取出,稍晾,再置容器内,用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖,闷使发酵至黄衣上遍时,取出,除去药渣,洗净,置容器内再闷 1520 d,至充分发酵、香气溢出时,取出,略蒸,干燥,即得。该工艺制法基本沿袭了本草纲目的记载。淡豆豉的鉴别部分采用的是薄层层析,测定部分采用大豆苷元
12、和染料木素两种成分的总和作为质量标准1。国内不同省份的地方性中药炮制规范也有淡豆豉的收录,制法基本同药典,添加的辅料成分稍有差异,其销售和应用具有地方性标准要求和限定。由于中药的发展历史悠久和生物学的落后,不论是药典还是地方炮制标准,关于淡豆豉的发酵微生物菌群,均没有具体界定。虽然发酵方法、工艺过程记载详细,但是优劣分辨、评判标准都比较模糊。中药淡豆豉的发酵过程主要是自然发酵,不同地域的自然环境中“黄衣上遍”菌株不同,有米曲霉、黑曲霉和其他霉菌的记载8,其密闭兼性厌氧发酵过程的微生物种类更是复杂多样化,筛分出发酵类食品或中药普遍存在的有益发酵菌,如枯草、地衣芽孢杆菌、酵母和乳杆菌等910。淡豆
13、豉的微生物菌群生物学特性与药效关系不明确,大豆异黄酮成分分解为苷元的过程是在“黄衣上遍”还是“厌氧密闭”尚不清楚;虽然很多科研工作者从豆豉或淡豆豉中分离筛选分泌纤溶酶的微生物菌株,但是其与日本的纳豆发酵菌株的单一性和溶栓效果还有一定差别;综合以上因素,连带中药淡豆豉原料的黑黄豆颜色、大小和形状之分,造成中药材市场中的淡豆豉质量参差不齐,甚至有些不能达到药典的要求。本研究采集了全国不同产地的食品豆豉和中药淡豆豉样本,对其黑黄豆原料、大小粒外观、形态和嗅味等进行了对比;测试了样本中大豆异黄酮和苷元成分的含量,按照药典的规定进行了数据分析;分离、筛选了样本中留存的微生物菌株,对菌株进行了初步的分类,
14、分析了发酵过程中微生物的种属、参与顺序和生物学功能,进一步探讨了淡豆豉发酵过程中生物酶活性与药效的关联性。为发酵类食品和曲类中药制备过程中的共性问题提供一定的材料佐证。1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 检测的样本 豆豉和淡豆豉测试的样本来源如表 1 所示,有地方性特产食品的豆豉,也有淡豆豉的中药饮片或者中药材。表 1 豆豉和淡豆豉样本 Table 1 Samples of Sojae Semen Praeparatum and Fermented Soya Bean 编号 名称 产地 原料 样本品类 外观及颜色 内芯颜色椭圆的长度/mm 长/宽/厚的比例 嗅味 1 淡豆豉 安徽 亳州
15、 大圆粒黑豆 中药材 黑色,褶皱,大多光滑,个别有白色绒膜 褐色10.94 1/0.76/0.68 豆豉味,无其他嗅味 2 黄毛淡豆豉、香豉 四川 泸州 小圆粒黑豆 食品 黑褐色,个别有白点 深褐色8.24 1/0.79/0.60 微香豆豉味 3 淡豆豉 安徽 涡阳 大圆粒黑豆 中药饮片 黑色,褶皱,大多光滑,个别有白色绒膜 深褐色8.94 1/0.72/0.69 豆豉味,无其他嗅味 4 淡豆豉 安徽 亳州 大圆粒黑豆 中药材 黑色,褶皱,大多光滑,个别有白色绒膜 褐色11.40 1/0.71/0.56 豆豉味,无其他嗅味 5 淡豆豉 安徽 毫州 大圆粒黑豆 食用农产品黑色,褶皱,大多光滑,个
16、别有白色绒膜 黑褐色10.24 1/0.78/0.68 豆豉味,无其他嗅味 6 豆豉 河北 辛集 小圆粒黄豆 农家自制食品 淡黄色,表面有褐绿色的绒膜黄白色9.72 1/0.64/0.57 豆酱味 7 淡豆豉 安徽 毫州 大、小圆粒黑豆代用茶 黑色,褶皱,大多光滑,个别有白色绒膜 褐色12.54(大 1/0.75/0.57)9.64(小 1/0.81/0.62)豆豉味,无其他嗅味 156 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 表 1(续)编号 名称 产地 原料 样本品类 外观及颜色 内芯颜色椭圆的长度/mm 长/宽/厚的比例 嗅味 8 无盐淡 豆豉 山东 临沂 中圆粒黑豆 食品
17、 黑色,表面光滑,少许有褶皱,大多有白色绒膜 浅褐色8.56 1/0.74/0.63 微香豆豉味 9 淡豆豉 广东 普宁 小瘪粒黑豆 中药材 黑色,褶皱,大多光滑,白色绒膜很少 青色6.98 1/0.68/0.46 纯正淡豆豉味道10 淡豆豉 四川 成都 小圆粒黑豆 中药材 黑色,不光滑,有白色绒膜 青色8.94 1/0.65/0.59 豆豉味,无其他嗅味 11 淡豆豉 广西 玉林 小瘪粒黑豆 中药材 黑色,褶皱 黑色7.46 1/0.79/0.23 豆豉味,无其他嗅味 12 淡豆豉 山东 泰安 大圆粒黑豆 古法食品 黑褐色,不光滑,有白色绒膜 青色11.42 1/0.63/0.46 豆豉味,
18、稍有 鱼香味 13 淡豆豉 江西 九江 大圆粒黑豆 食品 黑褐色,褶皱,粒不圆,不光滑,含水量大 棕褐色11.62 1/0.64/0.53 豆豉味道浓 14 淡豆豉 四川 成都 圆饼状黄豆 食品 黄褐色,有褶皱,个别有白色绒膜 浅褐色8.92 1/0.73 豆豉味 15 豆豉 广西 昭平 大瘪粒黑豆 特产食品 黑色,褶皱,个别有白色绒膜 黑色9.84 1/0.55/0.29 豆豉味道浓 16 淡豆豉 广东 揭阳 小瘪粒黑豆 食品 黑褐色,褶皱,不光滑 褐色7.66 1/0.63/0.29 豆豉味道 17 淡豆豉 安徽 亳州 大、小圆粒黑豆食品 黑色,光滑,褶皱,个别有白色绒膜 黑色11.94(
19、大 1/0.83/0.63)9.42(小 1/0.87/0.57)味道轻微 18 淡豆豉 河北 安国 小圆粒黑豆 农副产品 黑色,光滑,大多有黄色绒膜 褐色8.38 1/0.64/0.45 豆豉味 19 淡豆豉 湖北 襄阳 小瘪粒黑豆 初级农产品 黑色,光滑,褶皱,少数有白绒膜 褐色8.38 1/0.75/0.57 豆豉味较浓 20 干豆豉 湖北 恩施 圆饼状黄豆 食品 黄褐色表面 浅褐色7.26 1/0.73 食品,盐、辣椒、香辛料味道复杂,有豆豉味 21 无盐豆豉 湖南 长沙 大、小圆粒黑豆特产食品 黑色,瘪,光滑有褶皱 褐色10.38(大 1/0.66/0.37)8.72(小 1/0.5
20、6/0.34)豆豉味浓 22 豆豉 陕西 安康 圆饼状黄豆 食品 红褐色,去皮的黄豆瓣,含水量大 红褐色6.80 1/0.79 有辣椒等食品佐料味,也有豆豉味23 淡豆豉 四川 成都 圆饼状黄豆 食品 黄色,个别褐色,不光滑,有白色绒膜 浅褐色9.90 1/0.80 豆豉味,无杂味24 淡豆豉 安徽 亳州 大、小圆粒黑豆中药材 白色绒膜,无褶皱,干燥含水量小 褐色9.48(大 1/0.70/0.45)7.66(小 1/0.63/0.45)豆豉味 25 淡豆豉 河北 安国 小瘪粒黑豆 霉菌发酵的 药材 湿度大,黑色 黑色10.60 1/0.59/0.28 豆豉味轻微 注:普通样本是粒长度、宽度、
21、厚度的比例,圆饼状样本粒只有长度、厚度的比例。1.1.2 仪 器 Waters e2695 高效液相色谱仪、Waters Symmetry C18柱(250 mm4.6 mm,5 m)(美国 Waters 公司);FA2104N 电子分析天平(精度 0.0001 g,上海精琪仪器有限公司);DK-98 电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);PW-002恒温培养箱(重庆试验设备厂);苏净SW-2 FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);01010259 游标卡尺(杭州工具总厂);纤溶酶测试平板(自制)。1.1.3 试剂及标准品 黄豆黄苷、染料木苷、染料木素、大豆苷(纯度98%,北京索莱
22、宝科技有限公司);大豆苷元(纯度 100%,中国食品药品检定研究院);黄豆黄素(纯度98%,成都曼思特生物技术有限公司);乙腈、甲酸(色谱纯,德国默克公司);超纯水(娃哈哈集团有限公司);0.22 m微孔滤膜(天津市科亿隆实验设备有限公司);尿激酶 10 万单位(天津生物化学制药有限公司)。第 11 期 董 超,等:豆豉与淡豆豉的成分测试及微生物菌群分析 157 1.2 实验方法 1.2.1 豆豉和淡豆豉样本的外观和嗅味检测 分别取样本 1015 粒,观察其外观颜色,判断其原料的品类、特点;用游标卡尺测试其长度、宽度和厚度,圆饼状样本只测长度和厚度,以 1015 粒的均值为最终数据。以其大小和
23、形状判断其豆原料的品类;横切开其粒状样本,观察其横切面的颜色;并品鉴其嗅味。1.2.2 微生物菌株的筛选 称取豆豉或者淡豆豉样本 35 粒,放入 50 mL 菌水和玻璃珠的三角烧瓶中,振摇 30 min,使之充分混匀,依次制备 102、103、104不同稀释浓度的样本悬液。依次吸取不同稀释浓度的悬液 0.1 mL,均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 1:1 的混合平板上,并倒置放入 28恒温培养,2448 h 后,挑取单菌落。1.2.3 菌株的鉴别和筛选 圆点状或者放射状的黏性菌苔,涂玻片染色,显微镜观察,初步确定为细菌的菌株涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板,将平板倒置放
24、入 30恒温培养。如有不同外观、颜色的菌株产生,再次重复分别涂布,至细菌单菌落培养完成。有丝状或者孢子产生的,初步确定为真菌菌株,取菌丝或者孢子涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板,将平板倒置放入 28恒温培养,如有细菌类干扰,再次重复挑取,至真菌单菌落培养完成。1.2.4 纤溶酶活性的测试方法 改进版纤溶酶测试透明圈法,对照标品为尿激酶11。1.2.5 样本中黄酮类成分测试方法 取豆豉或淡豆豉样本约1 g,研钵粉碎后过2号筛,电子天平精密称重,置具塞锥形瓶中,加 70%甲醇 25 mL,加热沸腾,冷却回流,处理60 min,放冷,用70%甲醇补足减失的体积,摇匀,滤纸初滤过,取滤液,再过 0.2
25、2 m 微孔滤膜,即得12。分别精密称取大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素对照品适量,加甲醇制质量浓度分别为195.320、126.117、178.050、172.116、111.330、97.012 g/mL的混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液 1、2、4、8、12、16、20 L进入高效液相色谱仪,色谱柱为 Waters Symmetry C18柱(250 mm4.6 mm,5 m);流动相为 0.1%的冰醋酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(05 min,93%87%A;520 min,87%76%A;2035 min,72%A;3536 min),流速 1.01.
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