基因毒性杂质.ppt
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1、基因毒性杂质一、药品杂质研究评估策略二、痕量二、痕量杂质杂质定量分析方法的建立定量分析方法的建立提提 纲纲三、案例分析与三、案例分析与讨论讨论四、未知四、未知杂质杂质分离分离鉴鉴定案例分析定案例分析一、一、药药品品杂质杂质研究研究评评估策略估策略1.药品杂质研究的法规依据2.药品杂质评估一般步骤3.药品杂质来源途径分析4.药品杂质毒性判别方法5.药品杂质研究限度策略6.药品杂质风险评估的分析方法建立策略6杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效,甚至对人体的健康有害的物质产产品品质质量重点关注量重点关注杂质杂质:工艺杂质、降解杂质安全性重点关注高毒性安全性重点关注高毒性杂质杂质
2、:致癌、致突变类杂杂质中国药典、美国药典、欧洲药典、日本药典等各国药典ICH Q3A(R2):新型原料药中的杂质问题(2006.10)ICH Q3B(R2):新型药品中的杂质问题(2006.06)ICH Q3C(R6):杂质:残留溶剂的指导原则(2016.10)ICH Q3D:元素杂质的指导原则(2014.12)ICH Q11:原料药开发和生产(化学实体和生物技术生物实体药物)(2012.05)ICH M7(R1):评估和控制药物中DNA 反应性(致突变)杂质以限制潜在的致癌风险(2017.03)化学药品注射剂与包装材料相容性研究技术指导原则(塑料、玻璃、弹性体密封件)杂 质 研 究 相 关
3、法 规1.药品杂质研究的法规依据重点关注:法规适用范围2.药药品品杂质评杂质评估一般步估一般步骤骤杂质杂质引入方式引入方式限度制定限度制定已有研究的文献报道警示结构提示计算机模拟毒性评估体外点突变和染色体畸变试验动物毒性评估起始物料及其杂质溶剂及其杂质中间体反应副产物辅料杂质降解杂质生产设备引入包装材料引入环境污染引入一般杂质致癌致畸杂质PDE控制(存在报道)PDE控制(存在报道)TTC控制ICH Q3 A/B/C/D杂质杂质毒性分毒性分类类判定判定致癌、致突变关于PDE法与TTC法PDE法适用于有阈值效应的遗传毒性杂质;已有证据表明,该物质只有在超过一定限度时才会产生遗传毒性。杂质安全性限度
4、的确定可以参照残留溶剂限度的计算方法,根据相关动物的无可见效应剂量(No-Observed Effect Level)计算其可接受的日暴露量(Permissible Daily Exposure),再根据药品的最大日剂量计算出杂质的接受限度。关于PDE法与TTC法TTC法无阈值效应的遗传毒性杂质;引入了毒理学关注的阈值(Threshold of Toxicological Concern)。TTC是在接受患者终生用药的癌症发生概率不超过10万分之一的基础上,从高浓度下进行的致癌性实验数据线性外推倒极低浓度得到的一个理论值。对于无阈值效应的遗传毒性杂质,如果每日摄入量低于1.5ug,则患者因服药
5、导致癌症发生的额外风险可以忽略不记。8按属性按属性有机有机杂质杂质无机无机杂质杂质按来源按来源工工艺杂质艺杂质降解降解杂质杂质3.药品杂质来源途径分析路线1 路 线 2 路线3溶剂1,催化剂A+BC(A)时间、温度、pH(C)SI 溶剂杂质溶剂2,试剂RI 试剂杂质DS(DS)(D1,D2)(BP1,BP2)辅料制剂(D3,D4,E11,E12,)容器中的浸出物A,B=起始物料C=中间体R=试剂/催化剂 DS=药用辅料A=潜在的起始物料杂质产生C和DSBP=反应副产物 D=降解产物 SIRI IE=溶剂杂质=试剂杂质=辅料杂质EI 辅料杂质9药品杂质来源途径分析-容器中的浸出物来源10药物杂质
6、致癌致畸信息获取来源常见报道高毒性杂质具有警示结构杂质11药物杂质致癌致畸信息获取来源毒理学实验毒理学计算软件各类毒理学数据库已有文献报道获取TD50、NOEL、ADI、PMTDINOEL值与致癌致畸没有必然联系查询的毒性研究文献全面性以及毒性实验数据的解读需要专家的确认The Carcinogenic Potency Database(CPDB)联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会评价(JECFA)加利福尼亚州65号提案(安全饮用水和有毒物质强制法令)欧洲化学品管理局(ECHA)12常见物质的PDE数值举例在检索剂量数据前需要全面检索该物质是否有致癌致畸性,例如氯乙酸CPDB数据
7、TD50显示阴性盐酸盐的药物在重结晶过程中的接触醇类容易产生氯代烷烃,单一卤代物在M7中有36ug/day指导规则关注环氧丙醇、环氧氯丙烷、3-氯-1,2-丙二醇三者之间的转化关系毒性数据会被不断的更新,更多的研究数据会被不断的上传NameCASPDE(ug/day)Note氯氯甲甲烷烷74-87-31361ICH M7氯氯乙乙烷烷75-00-31810ICH M7氯氯异丙异丙烷烷75-29-655500ECHA氯氯乙酸乙酸79-11-83000ECHA/CPDB甲甲醛醛50-00-01.35 or 10000CPDB/ICH M7乙乙醛醛75-07-0153CPDB丙二丙二醛醛542-78-
8、9122CPDB(钠盐)环环氧丙醇氧丙醇556-52-54ICH M7环环氧氧氯氯丙丙烷烷106-89-82.96CPDB(TD50)3-氯氯-1,2-丙二醇丙二醇96-24-2PMTDI:4ug/kg/dayWHO/FAO1,3-二二氯氯-2-丙醇丙醇96-23-110NTP13最大日最大日剂剂量量报报告限度告限度鉴鉴定限度定限度界定限度界定限度2g0.05%0.10%或1.0mg(取最小值)0.15%或1.0mg(取最小值)2g0.03%0.05%0.05%报告限度最大日剂量1g1g限 度0.1%0.05%最大日剂量10mg 2g2g鉴定限度限 度1.0%或5ug(取最小值)0.5%或20
9、ug(取最小值)0.2%或2mg(取最小值)0.10%最大日剂量100mg2g2g界定限度限 度1.0%或50ug (取最小值)0.5%或200ug (取最小值)0.2%或3mg (取最小值)0.15%原料原料药药Q3A药药物物杂质杂质的控制限度的控制限度计计算(算()制制剂剂Q3B新药与仿制药研究策略有显著差异限度=PDE/日最大剂量PDE=TD50*体重/50000PDE=NOEL*体重/(F1*F2*F3*F4*F5)限度=TTC/日最大剂量由ppm推算NOEL(ICH Q3C)由LD50推算NOEL其他其他ICHQ3&M714PDE法计算限度实例(以三乙胺浓度限度计算为例)(错误案例解
10、析)公式公式1.1.NOEL=LD5070/2000NOEL=LD5070/2000(该该公式公式来来源于源于 EMEAEMEA关关于于清清洁洁验验证证的的指指导导原原则则)公式解释:NOEL(NOAEL)数据如果能直接查到就不需要计算了,直接进入到第2个公式;其中60是指的人体平均体重为60Kg;2000 是一个安全系数。查询美国TOXNET数据库,大鼠大鼠经经口的口的LD50=460mg/KgLD50=460mg/Kg,则NOEL=46070/2000=16.1 mg/Kg/day(错误推算)PDE=NOELPDE=NOEL(mg/Kg/daymg/Kg/day)WeightWeight
11、AdjustmentAdjustment(KgKg)/(F1F2F3F4F5)/(F1F2F3F4F5)PDE=16.1PDE=16.1 mg/Kg/day50Kg/(510511)=3.22mg/daymg/Kg/day50Kg/(510511)=3.22mg/day浓浓度限度限度()度()PDEPDE(mg/daymg/day)/(1000dose1000dose(g/dayg/day)100100对于原料药而言,dose均定为10g/day浓度限度()=3.22/(100010)100=0.0322%(322ppm)F1F1:种属之:种属之间间的的换换算系数,代表由物种差异推算系数,代表
12、由物种差异推导导的的变变异系数,与体表面异系数,与体表面积积相关相关 F1=5:从大鼠剂量推断人用剂量的系数;F1=12:从小鼠剂量推断人用剂量的系数 F1=2:从狗剂量推断人用剂量的系数;F1=2.5:从兔剂量推断人用剂量的系数F1=3:从猴子剂量推断人用剂量的系数;F1=10:从其他动物剂量推断人用剂量的系数 对于三乙胺,上述LD50是以大鼠为试验得来的数据,所以F1=5。F2F2:代表个体:代表个体间间的的变变异系数,其异系数,其值为值为F2=10F2=10;F3F3:为为短期接触急性毒性研究的可短期接触急性毒性研究的可变变系数:系数:F3=1,研究时间至少为动物寿命的一半(鼠、兔1年,
13、猫、狗、猴7年)F3=1,器官形成的整个过程的生殖研究F3=2,对啮齿类动物个月研究或非啮齿类动物3-5年的研究 F3=5,对啮齿类动物个月研究或非啮齿类动物年的研究 F3=10,更短时间的研究。在所有情况下,对研究时间介于上述时间点之间的研究,应用较大的系数,如对啮齿类动物个月毒性研究,其系数用。以上大鼠经口的LD50值为急毒数据,根据欧盟数据经验,这个研究时间在3-6个月之间,因此,F3=5。F4F4:产产生生严严重毒性情况的系数,如非重毒性情况的系数,如非遗传遗传致癌毒性、神致癌毒性、神经经毒性或致畸性,研毒性或致畸性,研究生殖毒性究生殖毒性时时,用以下系数:,用以下系数:F4=1 与母
14、体毒性有关的胎儿毒性;F4=无母体毒性的胎儿毒性 F4=受母体毒性影响的致畸反应;F4=10 无母体毒性影响的致畸反应 因为三乙胺为非严重毒性,所以这里F4=1。F5F5:一个可:一个可变变系数,用在无毒性反系数,用在无毒性反应应的的剂剂量(量(NOELNOEL)值时值时F5=1 for a NOEL;F5=1-5 for a NOAEL;F5=5-10 for a LOEL;F5=10 for a Lowest-observed-adverse-effect level(LOAEL)因为NOEL已经确定,所以这里F5=1。当研究没有区分NOAEL和NOEL,且依据确定的PDE值选择剂量时毒性
15、不被认为是“副作用”,则使用F5等于1,NOAEL用于多数元素的口服PDE值设定。三乙胺在ICH Q 3C中属于三类溶剂,限度:0.515由LD50推算PDE值建议原料药工厂中清洁验证指南一文中的NOEL 的单位是mg/天,而不是上文公式中的mg/kg/天LD50计算NOEL的公式:NOEL=LD5070/2000,公式中的70是欧洲人的评价体重如果需要用LD50计算NOEL用于计算PDE,推荐公式应该是NOEL=LD50/2000(见参考文献)不推荐在基因毒物质研究中使用推荐在包材研究的剂量计算中使用参考文献:D.W.Layton;B.J.Mallon;D.H.Rosenblatt;M.J.
16、Small Deriving allowable daily intakes for systemic toxicants lacking chronic toxicity data.Regulatory Toxicology&Pharmacology,1987,7(1):96-112药品杂质引入风险评估常见已知杂质引入途径起始物料及已知杂质中间体试剂&溶剂&催化剂反应副产物、降解杂质常见未知杂质引入途径起始物料引入未知杂质、起始物料杂质产生的杂质、生产设备引入的杂质包材浸出物杂质环境引入杂质(生产用水等)需要重点做风险评估工作17已知杂质研究策略讨论结构已知的杂质研究:起始物料及其已知杂质、
17、中间体、试剂、反应副产物、降解产物根据工艺路线梳理出产品待研究的杂质清单进行毒性杂质评估分类:文献报道、软件预测根据各国药典及ICH Q ABC规则分别建立有关物质和溶剂残留方法建立满足专属性和灵敏度的方法(LOQ30%限度浓度),收集多批次API中目标杂质含量基于已有的有关物质方法和溶剂残留方法,增加供试品浓度或改变检测器基于杂质检出情况制定杂质添加实验,考察工艺的杂质的去除能力基于杂质分类、毒性评估、产品检出情况制定方法学验证策略及产品控制策略18潜在及未知杂质研究策略讨论潜在及未知杂质来源:起始物料引入未知杂质、溶剂中杂质、包材浸出物杂质、辅料引入杂质、生产设备引入根据供应商提供的工艺路
18、线梳理杂质清单及潜在杂质,分别对元素杂质和有机杂质进行分类研究针对元素杂质采取ICPMS全质量数扫描(69种)和 35种元素半定量扫描针对挥发及半挥发杂质采用GCMS进行全质量数扫描(谱库匹配)及半定量分析(SIM模式)针对不挥发杂质采用LCMS 或 LC-MSMS进行全质量数扫描及半定量分析(SIM模式)购买疑似或近似杂质进行分析比对,确定研究目标根据杂质结构评估杂质的毒性,确定杂质的研究限度对比多批次中起始物料及其关联的原料药中杂质的检出情况根据杂质的来源风险及检出情况,制定杂质的控制策略二、痕量二、痕量杂质杂质分析方法的建立分析方法的建立1.痕量杂质分析的挑战与目标2.基于结构特性的分析
19、方法决策思路3.痕量分析方法建立步骤4.痕量物质定量方法的要素1.痕量杂质分析的挑战与目标痕量痕量杂质杂质分析的挑分析的挑战战含量低,选择性要求高,高灵敏度的仪器(GC-MS,LC-MSMS、ICPMS 等)杂质结构多样性和差异大,需要多种分析手段和方法样品基质复杂,需要合适的前处理方法进行分离,纯化,富集有些杂质具有“亚稳定性”的化学结构,在样品准备,制 备和分析过程中容易发生转化需要有经验的分析科学家好的分析方法好的分析方法简单容易操作,成本低通用性稳定性容易技术转移2.基于结构特性的分析方法决策思路易易挥发挥发分子分子是是GC条件条件稳稳定定否否是是HPLC条件条件稳稳定定吗吗是是HPL
20、C/UV HPLC/MS否否化学衍生化学衍生后引入后引入质谱质谱或紫外或紫外检测仪检测仪敏感基敏感基团团:GC/MS,LC/UV,LC/MS等方法等方法否否HPLC条件条件 下下稳稳定定吗吗否否是是碱性碱性酸性酸性富含富含杂杂原中性分子原中性分子,羟羟基基,羰羰基基,醚醚,酯酯等等等等富含共富含共轭轭 键键分子分子(+)电喷电喷离离 子化子化/质谱质谱(-)(-)电喷电喷离离 子化子化/质谱质谱化学化学电电离离/质谱质谱UV/UV/质谱质谱如不能达到如不能达到检测检测灵敏度灵敏度HS/GC/FID/MS如不能达到如不能达到 检测检测灵敏度灵敏度如不能达到如不能达到 检测检测灵敏度灵敏度3.痕量
21、分析方法建立步痕量分析方法建立步骤骤色色谱谱分离技分离技术术1)1)气相色气相色谱谱2)2)液相色液相色谱谱3)3)离子色离子色谱谱4)4)毛毛细细管管电电泳泳检测检测手段手段氢氢火火焰焰(FID)紫外紫外(UV)电电子子捕捕获获(ECD)EI质谱质谱(MS)ESI/APCI质谱质谱(MS/MS)荧荧光光检检测测(FLD)氮化学氮化学检测检测器器(CND)样品制备技术1)1)直接溶解直接溶解2)2)溶解后析出溶解后析出3)3)化学衍生法化学衍生法4)4)液液-液萃取液萃取5)5)固相萃取固相萃取选择选择何种何种组组合的分析方法取决于:合的分析方法取决于:API性性质质(溶解性、化学活性)(溶解
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