组织学基本技术.ppt

组织学基本技术内容提纲内容提纲uu组织的概念及研究内容组织的概念及研究内容uu组织学技术简介组织学技术简介uu组织标本的制备组织标本的制备uu组织化学与免疫组织化学术组织化学与免疫组织化学术uu组织学的学习方法组织学的学习方法1.组织学（组织学（Histology）概念）概念 研究机体的研究机体的微细结构微细结构及其相关及其相关功能功能的科学。的科学。2.研究内容研究内容 是在细胞水平、亚细胞水平和分子水平上对是在细胞水平、亚细胞水平和分子水平上对机体进行研究。机体进行研究。一、组织学概念及研究内容一、组织学概念及研究内容二、组织学技术简介二、组织学技术简介uu显微镜技术显微镜技术uu组织化学术组织化学术uu图像分析术图像分析术uu细胞培养术和组织工程细胞培养术和组织工程显微镜技术显微镜技术1616世世纪纪末末，荷荷兰兰的的眼眼镜镜商商 詹詹 森森（Zaccharias Zaccharias JanssenJanssen）和和他他的的儿儿子子把把几几块块镜镜片片放放进进了了一一个个圆圆筒筒中中，结结果果发发现现通通过过圆圆筒筒看看到到附附近近的的物物体体出出奇奇的的大大，这这就就是是现现在在的的显显微微镜镜和和望望远镜的前身。远镜的前身。uu詹詹森森制制造造的的第第一一台台复复合合式式显显微微镜镜。其其基基本本原原理理是是使使用用两两个个凸凸透透镜镜，一一个个凸凸透透镜镜把把另另外外一一个个所成的像进一步放大。所成的像进一步放大。显微镜的发展史显微镜的发展史uu世界上的第一架显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子世界上的第一架显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子世界上的第一架显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子世界上的第一架显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子在在在在15901590年前后制成的年前后制成的年前后制成的年前后制成的 ，效果不理想。，效果不理想。，效果不理想。，效果不理想。uu前后经过伽利略和胡克改良，效果较好前后经过伽利略和胡克改良，效果较好前后经过伽利略和胡克改良，效果较好前后经过伽利略和胡克改良，效果较好。uu18781878年，制成现代的光学显微镜年，制成现代的光学显微镜年，制成现代的光学显微镜年，制成现代的光学显微镜 。uu2020世纪世纪世纪世纪3030年代，制造了第一架电子显微镜年代，制造了第一架电子显微镜年代，制造了第一架电子显微镜年代，制造了第一架电子显微镜 。uu19811981年，扫描隧道显微镜应运而生。年，扫描隧道显微镜应运而生。年，扫描隧道显微镜应运而生。年，扫描隧道显微镜应运而生。根根根根据据据据光光光光源源源源不不不不同同同同，显显显显微微微微镜镜镜镜分分分分为为为为光光光光学学学学显显显显微微微微镜镜镜镜和和和和电电电电子子子子显显显显微微微微镜镜镜镜两两两两大大大大类。前者以类。前者以类。前者以类。前者以可见光可见光可见光可见光为光源，后者则以为光源，后者则以为光源，后者则以为光源，后者则以电子束电子束电子束电子束为光源。为光源。为光源。为光源。、光学显微镜、光学显微镜 （一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜 （二）荧光显微镜（二）荧光显微镜（二）荧光显微镜（二）荧光显微镜 （三）激光共聚焦扫描显微境（三）激光共聚焦扫描显微境（三）激光共聚焦扫描显微境（三）激光共聚焦扫描显微境 （四）暗视野显微镜（四）暗视野显微镜（四）暗视野显微镜（四）暗视野显微镜 （五）相差显微镜（五）相差显微镜（五）相差显微镜（五）相差显微镜 （六）偏光显微镜（六）偏光显微镜（六）偏光显微镜（六）偏光显微镜 （七）微分干涉差显微镜（七）微分干涉差显微镜（七）微分干涉差显微镜（七）微分干涉差显微镜 （八）倒置显微镜（八）倒置显微镜（八）倒置显微镜（八）倒置显微镜 显微镜技术显微镜技术尼康E-600光学显微镜普普通通光光学学显显微微镜镜由由二二部分构成：部分构成：光光学学部部分分：包包括括聚聚光镜、物镜和目镜；光镜、物镜和目镜；机机械械部部分分：包包括括镜镜臂、载物台等。臂、载物台等。尼康尼康E-600光学显微镜光学显微镜尼康尼康E800荧光显微镜荧光显微镜 荧荧荧荧光光光光显显显显微微微微镜镜镜镜由由由由光光光光源源源源、滤滤滤滤片片片片系系系系统统统统和和和和显显显显微微微微镜镜镜镜三三三三部部部部分分分分构构构构成成成成。光光光光源源源源为为为为高高高高压压压压汞汞汞汞灯灯灯灯，用用用用以以以以产产产产生生生生波波波波长短、能量高的紫外光。长短、能量高的紫外光。长短、能量高的紫外光。长短、能量高的紫外光。原原原原理理理理：紫紫紫紫外外外外光光光光激激激激发发发发标标标标本本本本中中中中的的的的荧荧荧荧光光光光物物物物质质质质，使使使使之之之之产产产产生生生生各各各各种种种种不不不不同同同同颜颜颜颜色色色色的的的的荧荧荧荧光光光光，通通通通过过过过观观观观察察察察荧荧荧荧光光光光的的的的分分分分布布布布与与与与强强强强弱弱弱弱来来来来测测测测定定定定被被被被检检检检物质。物质。物质。物质。研研研研究究究究内内内内容容容容：观观观观察察察察组组组组织织织织、细细细细胞胞胞胞中中中中有有有有自自自自发发发发荧荧荧荧光光光光或或或或经经经经荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料染色或标记的结构。染色或标记的结构。染色或标记的结构。染色或标记的结构。莱卡倒置显微镜莱卡倒置显微镜 倒倒置置显显微微镜镜：组组成成和和普普通通显显微微镜镜一一样样，不不同同处处物物镜镜与与照照明明系系统统颠颠倒倒，前前者者在在载载物物台台之上，后者在载物台之下。之上，后者在载物台之下。研研究究内内容容：观观察察细细胞胞培培养养中中活活细细胞胞的的形形态态结结构构和和生生长长变变化情况。化情况。倒倒置置相相差差显显微微镜镜：具具有有相相差差物物镜镜，使使活活细细胞胞的的不不同同结结构构出出现现显显著著的的明明暗暗反反差差，并并具具有立体感。有立体感。二、电子显微镜二、电子显微镜u 透射电镜透射电镜u 扫描电镜扫描电镜 透射电镜透射电镜观察细胞的内部结构观察细胞的内部结构 观察细胞表面的立体结构观察细胞表面的立体结构扫描电镜扫描电镜透射电镜标本制备步骤透射电镜标本制备步骤取材（约取材（约取材（约取材（约1mm1mm3 3）双重固定双重固定双重固定双重固定（双醛固定液和四氧化锇）（双醛固定液和四氧化锇）（双醛固定液和四氧化锇）（双醛固定液和四氧化锇）树脂包埋树脂包埋树脂包埋树脂包埋超薄切片超薄切片超薄切片超薄切片重金属染色重金属染色重金属染色重金属染色电镜观察电镜观察电镜观察电镜观察脱脱脱脱 水水水水扫描电镜标本制备步骤扫描电镜标本制备步骤取材（直径约取材（直径约取材（直径约取材（直径约0.3cm0.3cm）双重固定双重固定双重固定双重固定（双醛固定液和四氧化锇）（双醛固定液和四氧化锇）（双醛固定液和四氧化锇）（双醛固定液和四氧化锇）脱脱脱脱 水水水水干干干干 燥燥燥燥喷喷喷喷 镀镀镀镀电镜扫描观察电镜扫描观察电镜扫描观察电镜扫描观察显微组织标本的制备有多种方法，例如：切片法显微组织标本的制备有多种方法，例如：切片法显微组织标本的制备有多种方法，例如：切片法显微组织标本的制备有多种方法，例如：切片法（石蜡切片和冰冻切片）、涂片法、铺片法、（石蜡切片和冰冻切片）、涂片法、铺片法、（石蜡切片和冰冻切片）、涂片法、铺片法、（石蜡切片和冰冻切片）、涂片法、铺片法、磨片法等。组织学中磨片法等。组织学中磨片法等。组织学中磨片法等。组织学中最常用的方法是石蜡切片法最常用的方法是石蜡切片法最常用的方法是石蜡切片法最常用的方法是石蜡切片法。三、显微组织标本的制备三、显微组织标本的制备三、显微组织标本的制备三、显微组织标本的制备uu组织制片的意义和目的组织制片的意义和目的组织制片的意义和目的组织制片的意义和目的uu组织标本制作的方法组织标本制作的方法组织标本制作的方法组织标本制作的方法uu组织切片标本制作的基本程序组织切片标本制作的基本程序组织切片标本制作的基本程序组织切片标本制作的基本程序uu苏木精苏木精苏木精苏木精-伊红染色的程序伊红染色的程序伊红染色的程序伊红染色的程序组织制片的意义和目的组织制片的意义和目的组组织织制制片片技技术术是是随随着着生生命命科科学学的的发发展展而而不不断断进进步步的的。利利用用组组织织切切片片染染色色(staining)的的方方法法所所制制出出的的标标本本显显示示了了各各种种组组织织细细胞胞的的不不同同结结构构和和形形态态，它它们们之之间间的的相相互互连连接接及及它它们们之之中中的的某某些些化化学学成成分分的的种种类类和和含含量量的的变变化化，为为细细胞胞分分子子学学的的研研究究提提供供了了最最直直观观的的依依据据。因因此此，组组织织制制片片是是研研究究医医学学和和生生物学的一个物学的一个最基本和最重要最基本和最重要的手段。的手段。组织标本制作的方法组织标本制作的方法 uu 组织切片法组织切片法uu 非组织切片法非组织切片法组组织织切切片片法法：利利用用化化学学试试剂剂将将组组织织经经过过一一系系列列的的固固定定(fixation)、脱脱水水、透透明明后后，再再利利用用石石蜡蜡或或火火棉棉胶胶和和明明胶胶等等支支持持物物渗渗透透进进组组织织内内部部，使使组组织织保保持持一一定定的的硬硬度度，并并包包埋埋(embedding)成成块块，然然后后依依靠靠切切片片机机(microtome)将将包包埋埋好好的的组组织织块块切切成成以以微微米米计计的的薄薄片片，再再根根据据需需要要进进行行各各种种染染色色得得到到的的供供显显微微镜镜下下观观察察的的标标本本的的方方法法。包包括括：石石蜡蜡切切片片、火火棉棉胶胶切切片片、明胶切片，冰冻切片。明胶切片，冰冻切片。组组织织不不经经过过切切片片手手续续制制成成的的观观察察标标本本的的方方法法为为非非组组织织切切片片法法。包包括括：涂涂片片、压压片片、铺铺片片、磨磨片片、消消化化分离、活体标本、整装标本、血管注射标本。分离、活体标本、整装标本、血管注射标本。涂涂片片：将将所所采采的的血血液液或或骨骨髓髓样样品品涂涂抹抹于于载载玻玻片片上上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。压压片片：先先将将组组织织处处理理成成小小块块物物质质，然然后后经经化化学学药药品品软软化化和和染染色色，再再用用盖盖玻玻片片压压封封于于载载玻玻片片上上的的标标本本。例如运动终板等。例如运动终板等。非组织切片法非组织切片法铺铺片片：将将需需要要观观察察的的薄薄片片组组织织用用手手工工的的方方法法直直接接铺铺于于载载玻玻片片上上，然然后后经经过过固固定定、染染色色等等程程序序制制成成的的标标本本。例例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。磨磨片片：骨骨，牙牙齿齿等等组组织织，不不经经脱脱钙钙和和切切片片，直直接接在在磨磨石石上上用用手手工工磨磨成成大大约约50微微米米左左右右的的薄薄片片，然然后后再再进进行行染染色封固在载玻片上的标本。色封固在载玻片上的标本。消消化化分分离离：将将组组织织分分离离成成小小块块，然然后后利利用用相相应应的的化化学学药药品品水水溶溶液液将将其其细细胞胞间间质质消消化化溶溶去去，再再用用机机械械分分离离的的方方法法，如如利利用用水水的的震震荡荡冲冲击击力力等等，使使小小块块组组织织分分离离成成单单个个而而又又完完整整的的细细胞胞，经经染染色色后后涂涂于于载载玻玻片片上上封封固固的的标标本本。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。活活体体标标本本：将将所所采采的的观观察察标标本本加加生生理理盐盐水水后后直直接接滴滴于于载载玻片上在显微镜下观察。玻片上在显微镜下观察。整整装装标标本本：一一种种是是将将胚胚胎胎或或小小动动物物经经前前期期固固定定后后整整体体封封藏藏于于盛盛满满固固定定剂剂的的透透明明容容器器中中。另另一一种种是是将将发发育育至至某某一一阶阶段段的的鸡鸡胚胚整整体体取取出出，经经固固定定、染染色色、脱脱水水、透透明明后后封封固固于于载玻片上的标本。载玻片上的标本。血血管管注注射射标标本本：一一种种是是将将有有色色物物质质注注射射进进血血管管，用用酸酸或或硷硷将将血血管管周周围围的的组组织织腐腐蚀蚀后后做做成成的的整整体体封封藏藏的的血血管管标标本本。另另一一种种是是将将有有色色物物质质注注射射进进血血管管后后，经经一一系系列列制制片片技技术术处处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。切片：用于具有一定硬度的组织，例如肝、肾等切片：用于具有一定硬度的组织，例如肝、肾等涂片涂片:用于液态组织，如血液，精液和唾液。用于液态组织，如血液，精液和唾液。铺片铺片:用于很薄的组织，如肠系膜。用于很薄的组织，如肠系膜。磨片磨片:用于很坚硬的组织，如骨和牙。用于很坚硬的组织，如骨和牙。石蜡切片制作步骤石蜡切片制作步骤石蜡切片的制备石蜡切片的制备（一）取材（一）取材注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：材料材料材料材料愈新鲜愈好愈新鲜愈好愈新鲜愈好愈新鲜愈好，动作要迅速、准确，防止组织发，动作要迅速、准确，防止组织发，动作要迅速、准确，防止组织发，动作要迅速、准确，防止组织发生变形、自溶；生变形、自溶；生变形、自溶；生变形、自溶；取材所用的刀和剪要取材所用的刀和剪要取材所用的刀和剪要取材所用的刀和剪要锐利锐利锐利锐利，避免损伤组织；，避免损伤组织；，避免损伤组织；，避免损伤组织；取材部位要恰当、取材部位要恰当、取材部位要恰当、取材部位要恰当、准确准确准确准确，易于说明问题；，易于说明问题；，易于说明问题；，易于说明问题；所取组织块大小要所取组织块大小要所取组织块大小要所取组织块大小要恰当恰当恰当恰当，便于固定液的渗透。组织，便于固定液的渗透。组织，便于固定液的渗透。组织，便于固定液的渗透。组织的大小以的大小以的大小以的大小以1X1X0.3cm1X1X0.3cm为宜，厚度一般不超过为宜，厚度一般不超过为宜，厚度一般不超过为宜，厚度一般不超过0.5cm0.5cm。（二）固定（二）固定目目的的：使使组组织织内内的的蛋蛋白白质质迅迅速速凝凝固固或或沉沉淀淀，防防止止细细胞胞自自溶溶或或组组织织腐腐败败，尽尽量保持组织的原有结构和化学组成。量保持组织的原有结构和化学组成。u 单纯固定液单纯固定液 4%中中性性甲甲醛醛：用用PH7.2-7.4的的PBS配配制制，配配制制后后密密封封、4保保存存，保保存存时时间间不不超超过过一一个个月月。适适用用HE染色和免疫组化。染色和免疫组化。4%多聚甲醛：用多聚甲醛：用PH7.2-7.4的的PBS配制。配制。乙醇混合固定液乙醇混合固定液u 复合固定液复合固定液 AF（乙醇（乙醇-甲醛）固定液甲醛）固定液 Bouin固定液固定液 Carnoy固定液固定液 Zenker固定液固定液固定液的种类固定液的种类固定方法固定方法uu 浸透固定：将组织切成小块，直接浸透固定：将组织切成小块，直接浸透固定：将组织切成小块，直接浸透固定：将组织切成小块，直接 投入固定液中固定。投入固定液中固定。投入固定液中固定。投入固定液中固定。uu 灌注固定：一般采用心脏灌注固定。灌注固定：一般采用心脏灌注固定。灌注固定：一般采用心脏灌注固定。灌注固定：一般采用心脏灌注固定。固定更加迅速、均匀。固定更加迅速、均匀。固定更加迅速、均匀。固定更加迅速、均匀。尤其适用神经组织。尤其适用神经组织。尤其适用神经组织。尤其适用神经组织。固定注意事项固定注意事项1.及及时时固固定定：最最好好动动物物死死后后半半小小时时内内固固定定，一一般般不超过不超过2小时。小时。2.固固定定液液选选择择：根根据据组组织织的的特特点点、染染色色方方法法选选择择合适的固定液。合适的固定液。3.固定液的量：一般为组织体积的固定液的量：一般为组织体积的6-10倍。倍。4.固固定定时时间间：在在保保存存组组织织形形态态结结构构的的同同时时，尽尽可可能较好保存组织细胞的抗原。能较好保存组织细胞的抗原。5.固定温度：低温可以保持好的结构。固定温度：低温可以保持好的结构。高效、方便、快捷的全自动形态检测平台！高效、方便、快捷的全自动形态检测平台！（三）染色（三）染色u HE染色染色（hematoxylin-eosin staining）：组：组织学最常用的染色方法。织学最常用的染色方法。u 特殊染色：特殊染色：硝酸银染色、醛复红染色、甲苯硝酸银染色、醛复红染色、甲苯胺蓝染色等。胺蓝染色等。镀银染色镀银染色神经元神经元H.E染色染色苏木精苏木精苏木精苏木精碱性染料碱性染料碱性染料碱性染料将嗜碱性物质染成蓝色将嗜碱性物质染成蓝色将嗜碱性物质染成蓝色将嗜碱性物质染成蓝色酸性染料酸性染料酸性染料酸性染料将嗜酸性物质将嗜酸性物质将嗜酸性物质将嗜酸性物质染成红色染成红色染成红色染成红色细胞核中的染色质细细胞核中的染色质细细胞核中的染色质细细胞核中的染色质细胞质中的核糖体胞质中的核糖体胞质中的核糖体胞质中的核糖体 多数细胞的细胞质多数细胞的细胞质多数细胞的细胞质多数细胞的细胞质（线粒体（线粒体（线粒体（线粒体、溶酶体溶酶体溶酶体溶酶体、滑面内质网滑面内质网滑面内质网滑面内质网）HE染色染色嗜碱性嗜碱性嗜碱性嗜碱性嗜酸性嗜酸性嗜酸性嗜酸性伊红伊红伊红伊红细胞爬片制作细胞爬片制作uu将处理好的盖玻片放入接种了细胞的将处理好的盖玻片放入接种了细胞的将处理好的盖玻片放入接种了细胞的将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。培养瓶或六孔板内。培养瓶或六孔板内。培养瓶或六孔板内。uu待细胞生长达到待细胞生长达到待细胞生长达到待细胞生长达到6060以上后取出玻片。以上后取出玻片。以上后取出玻片。以上后取出玻片。uu用用用用4%4%的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定2h2h以上。以上。以上。以上。uu可加甘油封存置于零下可加甘油封存置于零下可加甘油封存置于零下可加甘油封存置于零下2020 保存。保存。保存。保存。细胞涂片制作细胞涂片制作uu离心将细胞收集出来，用预冷的离心将细胞收集出来，用预冷的离心将细胞收集出来，用预冷的离心将细胞收集出来，用预冷的PBSPBS洗洗洗洗2 23 3遍，遍，遍，遍，最后用最后用最后用最后用PBSPBS将细胞重悬。将细胞重悬。将细胞重悬。将细胞重悬。uu吸取吸取吸取吸取303050ul50ul（可根据细胞量调整）滴至处理（可根据细胞量调整）滴至处理（可根据细胞量调整）滴至处理（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。过的载玻片上，然后涂抹均匀。过的载玻片上，然后涂抹均匀。过的载玻片上，然后涂抹均匀。uu待稍微风干以后加待稍微风干以后加待稍微风干以后加待稍微风干以后加4 4多聚甲醛溶液覆盖细胞，多聚甲醛溶液覆盖细胞，多聚甲醛溶液覆盖细胞，多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定固定固定固定2 24 4小时。小时。小时。小时。uu在细胞上加一层甘油放在细胞上加一层甘油放在细胞上加一层甘油放在细胞上加一层甘油放-20-20保存。保存。保存。保存。组组组组织织织织化化化化学学学学技技技技术术术术概概概概念念念念：应应应应用用用用化化化化学学学学反反反反应应应应或或或或免免免免疫疫疫疫学学学学反反反反应应应应等等等等原原原原理理理理检检检检测测测测组组组组织织织织和和和和细细细细胞胞胞胞的的的的化化化化学学学学成成成成分分分分并并并并进进进进行行行行定定定定位位位位、定定定定量量量量的的的的技技技技术术术术。包包包包括括括括一一一一般般般般组组组组织织织织化化化化学学学学、免免免免疫疫疫疫组组组组织织织织化化化化学学学学、原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交组织化学等。组织化学等。组织化学等。组织化学等。四四、组织化学与免疫组织化学术组织化学与免疫组织化学术 原原原原理理理理：组组织织细细胞胞中中的的物物质质（核核酸酸、糖糖类类、脂脂类类、蛋蛋白白质质等等）与与相相应应试试剂剂反反应应，最最后后形形成成有有色色终终产产物物，通通过过有有色色终终产产物物在在细细胞胞中中的的定定位位及及颜颜色色的的深深浅浅来来判判断断某某种种物物质质在在细细胞胞中中的分布和含量。的分布和含量。特特特特点点点点：能能在在组组织织学学标标本本上上，定定位位、定定性性和和定量地显示分布于组织或细胞内某些物质。定量地显示分布于组织或细胞内某些物质。糖类糖类 过碘酸过碘酸-Schiff反应（反应（PAS反应）反应）DNA 福尔根反应（福尔根反应（Feulgen reaction）DNA 和和RNA甲基绿甲基绿-派若宁反应派若宁反应 脂类脂类脂溶性染料（苏丹红、油红脂溶性染料（苏丹红、油红O等）等）酶类酶类生化反应生化反应（一）一般组织化学术（一）一般组织化学术（Histochemistry）PASPAS反应：反应：反应：反应：确定组织或细胞中有无多糖存在的确定组织或细胞中有无多糖存在的确定组织或细胞中有无多糖存在的确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。反应产物呈紫红色。一种方法。反应产物呈紫红色。一种方法。反应产物呈紫红色。一种方法。反应产物呈紫红色。FeulgenFeulgen反应：反应：反应：反应：显示显示显示显示DNADNA，呈红色。，呈红色。，呈红色。，呈红色。甲基绿甲基绿甲基绿甲基绿-派若宁反应：派若宁反应：派若宁反应：派若宁反应：同时显示同时显示同时显示同时显示DNADNA核核核核RNARNA，DNADNA呈蓝绿色，呈蓝绿色，呈蓝绿色，呈蓝绿色，RNARNA呈红色。呈红色。呈红色。呈红色。洋葱鳞茎内表皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞苏丹红染色：苏丹红染色：苏丹红染色：苏丹红染色：脂类物质呈红色。脂类物质呈红色。脂类物质呈红色。脂类物质呈红色。冰冻切片对脂类物质保持较好。冰冻切片对脂类物质保持较好。冰冻切片对脂类物质保持较好。冰冻切片对脂类物质保持较好。酶酶酶酶类类类类：在在在在适适适适当当当当温温温温度度度度和和和和PHPH条条条条件件件件下下下下，酶酶酶酶催催催催化化化化特特特特异异异异性性性性底底底底物物物物形形形形成成成成初初初初级级级级反反反反应应应应产产产产物物物物，再再再再用用用用捕捕捕捕捉捉捉捉剂剂剂剂捕捕捕捕获获获获该该该该产产产产物物物物，形形形形成成成成镜镜镜镜下下下下可可可可见见见见的的的的有有有有色色色色沉沉沉沉淀淀淀淀物物物物。该该该该技技技技术术术术检检检检测的不是酶本身，而是酶的活性。测的不是酶本身，而是酶的活性。测的不是酶本身，而是酶的活性。测的不是酶本身，而是酶的活性。（二）免疫组织化学术（二）免疫组织化学术（immunohistochemistry）1.1.概概概概念念念念及及及及原原原原理理理理：根根据据抗抗原原和和抗抗体体特特异异性性结结合合原原理理，检检测测组组织织、细细胞胞中中多多肽肽和和蛋蛋白白质质等等大大分分子子物物质质的的一一种种技技术术。用用标标记记的的抗抗体体与与组组织织中中的的抗抗原原结结合合，然然后后通通过过化化学学反反应应，将将抗抗原原抗抗体体结结合合部部位位显显示示出出来来，借借助显微镜观察，确定检测物质的助显微镜观察，确定检测物质的分布、含量分布、含量。2.标记物种类标记物种类 荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料：例如异硫氰酸荧光素（：例如异硫氰酸荧光素（：例如异硫氰酸荧光素（：例如异硫氰酸荧光素（FITCFITC），），），），四甲基异硫氰酸罗达明（四甲基异硫氰酸罗达明（四甲基异硫氰酸罗达明（四甲基异硫氰酸罗达明（TMRITCTMRITC），），），），用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察 酶类酶类酶类酶类：例如辣根过氧化物酶，用光镜或电镜观察。：例如辣根过氧化物酶，用光镜或电镜观察。：例如辣根过氧化物酶，用光镜或电镜观察。：例如辣根过氧化物酶，用光镜或电镜观察。胶体金胶体金胶体金胶体金：多用于电镜观察。：多用于电镜观察。：多用于电镜观察。：多用于电镜观察。免疫组织化学原理模式图免疫组织化学原理模式图 抗原抗原 抗体抗体 抗原抗体复合物抗原抗体复合物 荧光素荧光素辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶胶体金胶体金3.免疫组化技术的种类免疫组化技术的种类根据根据染色步骤染色步骤分：分：u 直直接接法法：直直接接标标记记第第一一抗抗体体。该该法法简简单单，特特异异性强，但敏感性较差。性强，但敏感性较差。u 间间接接法法：不不标标记记第第一一抗抗体体，标标记记第第二二抗抗体体。该该法敏感性较高。法敏感性较高。u 特特殊殊的的间间接接法法：第第一一抗抗体体和和第第二二抗抗体体均均不不标标记记，而而是是用用酶酶标标记记与与第第二二抗抗体体结结合合的的物物质质。该该法法敏敏感感性高。包括性高。包括PAP法、法、ABC法、法、SABC法等。法等。根据根据根据根据标记不同标记不同标记不同标记不同分：分：分：分：uu 免疫荧光技术：免疫荧光技术：免疫荧光技术：免疫荧光技术：uu 免疫胶体金技术：免疫胶体金技术：免疫胶体金技术：免疫胶体金技术：uu 免免免免疫疫疫疫酶酶酶酶标标标标技技技技术术术术：目目目目前前前前最最最最常常常常用用用用的的的的方方方方法法法法。包包包包括括括括PAPPAP法法法法、ABCABC法法法法、SABCSABC法法法法等等等等。与与与与免免免免疫疫疫疫荧荧荧荧光光光光技技技技术术术术比比比比较较较较，其其其其优优优优点点点点定定定定位位位位准准准准确确确确、对对对对比比比比度度度度好好好好，染染染染色色色色标标标标本本本本可可可可长长长长期期期期保保保保存，适合光镜、电镜研究。存，适合光镜、电镜研究。存，适合光镜、电镜研究。存，适合光镜、电镜研究。荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学 直接法直接法 间接法间接法免疫组织化学（荧光素标记）免疫组织化学（荧光素标记）毛细血管内皮细胞呈毛细血管内皮细胞呈vWF阳性阳性血管性假血友病因子血管性假血友病因子 Nucleus and ActinEndoplasmic ReticulumNucleus and MicrotubulesActin and MicrotubulesCellular StructuresThe Golgi ApparatusStages of Mitosis酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学u ABC法法：一一抗抗生生物物素素化化二二抗抗abc复复合合物物u S-P法法：一一抗抗生生物物素素化化二二抗抗HRP标标记记的的链霉卵白素链霉卵白素免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）大肠肌动蛋白大肠肌动蛋白大肠肌动蛋白大肠肌动蛋白actinactin阳性阳性阳性阳性4.免疫组化技术的注意事项：免疫组化技术的注意事项：uu 组织固定愈新鲜愈好。固定液多用组织固定愈新鲜愈好。固定液多用组织固定愈新鲜愈好。固定液多用组织固定愈新鲜愈好。固定液多用4%4%多聚多聚多聚多聚甲醛，固定时间不宜过长。甲醛，固定时间不宜过长。甲醛，固定时间不宜过长。甲醛，固定时间不宜过长。uu 组织脱水必需彻底。组织脱水必需彻底。组织脱水必需彻底。组织脱水必需彻底。uu 切片必需完整，平展，无气泡、皱褶。切片必需完整，平展，无气泡、皱褶。切片必需完整，平展，无气泡、皱褶。切片必需完整，平展，无气泡、皱褶。uu 切片贴附必需牢固：载玻片需做特殊处理。切片贴附必需牢固：载玻片需做特殊处理。切片贴附必需牢固：载玻片需做特殊处理。切片贴附必需牢固：载玻片需做特殊处理。uu 切片脱蜡彻底。切片脱蜡彻底。切片脱蜡彻底。切片脱蜡彻底。4.免疫组化技术的注意事项：免疫组化技术的注意事项：uu 彻彻彻彻底底底底抑抑抑抑制制制制内内内内源源源源性性性性过过过过氧氧氧氧化化化化物物物物酶酶酶酶活活活活性性性性，降降降降低低低低背背背背景景景景染染染染色常用抑制剂是色常用抑制剂是色常用抑制剂是色常用抑制剂是3%3%的过氧化氢。的过氧化氢。的过氧化氢。的过氧化氢。uu 合合合合理理理理使使使使用用用用封封封封闭闭闭闭剂剂剂剂，目目目目的的的的减减减减少少少少非非非非特特特特异异异异性性性性染染染染色色色色。封封封封闭闭闭闭血血血血清清清清一一一一般般般般是是是是和和和和二二二二抗抗抗抗同同同同一一一一来来来来源源源源，也也也也可可可可以以以以用用用用羊羊羊羊血血血血清、小牛血清等，但不能与一抗来源一致。清、小牛血清等，但不能与一抗来源一致。清、小牛血清等，但不能与一抗来源一致。清、小牛血清等，但不能与一抗来源一致。uu 抗原修复：抗原修复：抗原修复：抗原修复：4.免疫组化技术的注意事项：免疫组化技术的注意事项：u 选择合适抗体。选择合适抗体。u 抗体使用注意事项。抗体使用注意事项。u PBS的冲洗：的冲洗：PBS的要求：的要求：PH 7.2-7.6；浓度：；浓度：0.02M。单独冲洗单独冲洗 温柔冲洗温柔冲洗 冲洗彻底冲洗彻底4.免疫组化技术的注意事项：免疫组化技术的注意事项：u DAB显色注意事项：显色注意事项：DAB是一种致癌物，严禁倒入水池，同时是一种致癌物，严禁倒入水池，同时注意自我保护。注意自我保护。新鲜配制：显色前新鲜配制：显色前10-15分钟配制。分钟配制。室温显色，需要在镜下控制显色时间，一室温显色，需要在镜下控制显色时间，一般在般在5-30分钟。分钟。洗涤剂清洗洗涤剂清洗泡泡 酸酸临用前防脱处理临用前防脱处理（明胶、多聚赖氨酸、（明胶、多聚赖氨酸、APES）流水冲洗流水冲洗烤箱烤干烤箱烤干流水冲洗流水冲洗蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗烤箱烤干烤箱烤干37干燥备用干燥备用免疫组织载玻片特殊处理步骤免疫组织载玻片特殊处理步骤组织制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了部分抗原，组织制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了部分抗原，组织制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了部分抗原，组织制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了部分抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，导致免又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，导致免又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，导致免又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，导致免疫组化染色过程中不能将其彻底显示，为了解决上述的疫组化染色过程中不能将其彻底显示，为了解决上述的疫组化染色过程中不能将其彻底显示，为了解决上述的疫组化染色过程中不能将其彻底显示，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露或问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露或问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露或问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露或修正的过程称为修正的过程称为修正的过程称为修正的过程称为抗原修复抗原修复抗原修复抗原修复。常用的抗原修复方法有。常用的抗原修复方法有。常用的抗原修复方法有。常用的抗原修复方法有微波微波微波微波修复法、高压加热法、水煮加热法、酶消化法修复法、高压加热法、水煮加热法、酶消化法修复法、高压加热法、水煮加热法、酶消化法修复法、高压加热法、水煮加热法、酶消化法等，常用等，常用等，常用等，常用的修复液是的修复液是的修复液是的修复液是PH6.0PH6.0的的的的mol/Lmol/L的柠檬树缓冲液。的柠檬树缓冲液。的柠檬树缓冲液。的柠檬树缓冲液。抗原修复抗原修复1.一一抗抗选选择择：选选择择单单克克隆隆抗抗体体还还是是多多克克隆隆抗抗体体。单单克克隆隆抗抗体体特特异异性性强强，灵灵敏敏度度较较低低；多多克克隆隆抗抗体体特特异异性性稍稍弱弱，灵灵敏敏度度高高，易易出出现现非非特特异异性性染染色色。通通过过实实验验动动物物选选择择种种属属来来源源。能能否否做做免免疫疫组组化化。检检测测标标本本类类型型：石石蜡蜡切切片片、冰冰冻冻切切片片生生产厂家：国内、国外。产厂家：国内、国外。2.二抗选择：根据一抗种属选择二抗种属来源二抗选择：根据一抗种属选择二抗种属来源。抗体选择抗体选择1.抗抗体体保保存存：浓浓缩缩液液于于-80可可保保存存三三年年左左右右。购购买买后后，应应在在无无菌菌条条件件下下，将将抗抗体体分分装装成成小小包包装装，蜡蜡膜膜密密封封。禁忌反复冻融。禁忌反复冻融。2.选选择择最最佳佳抗抗体体稀稀释释度度：抗抗体体稀稀释释液液用用山山羊羊血血清清、BSA或脱脂奶粉等。或脱脂奶粉等。3.抗体的加入：切片湿润，滴入抗体量以一滴抗体的加入：切片湿润，滴入抗体量以一滴50ul为好。为好。4.选选择择合合适适的的孵孵育育时时间间：4孵孵育育过过夜夜，室室温温2小小时时，37 30-60分钟。分钟。抗体使用注意事项抗体使用注意事项必必必必须须须须设设设设染染染染色色色色对对对对照照照照：每每每每批批批批染染染染色色色色都都都都要要要要以以以以特特特特异异异异性性性性的的的的阳阳阳阳性性性性对对对对照照照照和和和和阴阴阴阴性性性性对对对对照照照照为为为为基基基基础础础础，才才才才能能能能对对对对染染染染色色色色结结结结果果果果做做做做出出出出正正正正确的判断。确的判断。确的判断。确的判断。抗抗抗抗原原原原表表表表达达达达必必必必须须须须在在在在特特特特定定定定部部部部位位位位：阳阳阳阳性性性性表表表表达达达达必必必必须须须须在在在在细细细细胞胞胞胞和和和和组组组组织织织织特特特特定定定定的的的的抗抗抗抗原原原原部部部部位位位位才才才才能能能能视视视视为为为为阳阳阳阳性性性性，阳阳阳阳性性性性细细细细胞胞胞胞染染染染色色色色分分分分布布布布有有有有三三三三种种种种类类类类型型型型：胞胞胞胞浆浆浆浆、胞胞胞胞膜膜膜膜、胞胞胞胞核核核核。不不不不在在在在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。5.免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则阴阴阴阴性性性性结结结结果果果果不不不不能能能能视视视视为为为为抗抗抗抗原原原原不不不不表表表表达达达达：即即即即阴阴阴阴性性性性结结结结果果果果不不不不能能能能认认认认为为为为具具具具有有有有否否否否定定定定意意意意义义义义；阳阳阳阳性性性性表表表表达达达达有有有有强强强强弱弱弱弱、多多多多少少少少之之之之分分分分，哪哪哪哪怕怕怕怕是是是是只只只只是是是是有有有有少少少少数数数数细细细细胞胞胞胞阳阳阳阳性性性性（但但但但要要要要在在在在抗抗抗抗原原原原所所所所在在在在部部部部位位位位）也也也也要要要要视视视视为为为为阳阳阳阳性性性性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。免免免免疫疫疫疫组组组组化化化化与与与与HEHE切切切切片片片片诊诊诊诊断断断断应应应应以以以以HEHE切切切切片片片片诊诊诊诊断断断断为为为为准准准准：当当当当免免免免疫疫疫疫组组组组化化化化诊诊诊诊断断断断结结结结果果果果与与与与HEHE切切切切片片片片诊诊诊诊断断断断不不不不一一一一致致致致时时时时，应应应应再再再再结结结结合合合合临临临临床床床床资资资资料料料料、X X线线线线等等等等影影影影像像像像学学学学及及及及实实实实验验验验室室室室结结结结果果果果综综综综合合合合分分分分析析析析，不不不不能能能能用用用用免免免免疫组化检查结果推翻疫组化检查结果推翻疫组化检查结果推翻疫组化检查结果推翻HEHE切片诊断。切片诊断。切片诊断。切片诊断。所所所所用用用用的的的的抗抗抗抗体体体体特特特特异异异异性性性性差差差差，与与其其它它无无关关的的抗抗原原有有交交叉叉反反应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。抗抗抗抗体体体体浓浓浓浓度度度度过过过过高高高高或或或或染染染染色色色色过过过过程程程程中中中中切切切切片片片片干干干干燥燥燥燥，导导致致抗抗体体与与组织产组织产 生非特异性结合。生非特异性结合。出出血血和和坏坏死死：红红细细胞胞的的内内源源性性过过氧氧化化