PPT医学课件HIV抗体初筛试验讲义.ppt

HIVHIV抗体检测的目的和要点抗体检测的目的和要点n目的目的 诊断诊断 血液筛查血液筛查 监测监测n要点要点 根据目的选择检测方法及检测策略根据目的选择检测方法及检测策略 !严格遵守实验室严格遵守实验室SOPSOP 筛查试验阳性筛查试验阳性需做确证试验需做确证试验 筛查试验阴性筛查试验阴性不应做确认试验不应做确认试验 筛查及确证试验均应做好咨询工作筛查及确证试验均应做好咨询工作HIVHIV抗体筛查试验抗体筛查试验n试剂试剂 储存温度储存温度 效期效期n样品样品 血清血清 血浆血浆 全血全血n方法方法 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA 化学发光或免疫荧光实验化学发光或免疫荧光实验 快速检测快速检测(RT)(RT)及其它检测试验及其它检测试验 明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验 （PAPA）免疫渗滤试验免疫渗滤试验 免疫层析试验免疫层析试验 免疫胶体金法（硒）免疫胶体金法（硒）n免疫胶体金法免疫胶体金法 阴性阴性 质控区（质控区（C C）出现红色反应线）出现红色反应线 阳性阳性 质控区（质控区（C C）出现红色反应线）出现红色反应线 检测区（检测区（T T）出现红色反应线）出现红色反应线 无效无效 质控区质控区 （C C）未出现红色反应线）未出现红色反应线HIVHIV抗体抗体筛查筛查试验试验HIVHIV抗体抗体筛查筛查试验试验n酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）方法类型方法类型 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 捕获法测抗体捕获法测抗体 间接法测抗体间接法测抗体 竞争法测抗原竞争法测抗原 抗体抗体用于检测用于检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA法法n第一代：使用第一代：使用HIVHIV全病毒裂解物为抗原，应用全病毒裂解物为抗原，应用间接法间接法原理检测原理检测HIVHIV抗体。如日本富士公司生抗体。如日本富士公司生产的产的HIV-PAHIV-PA试剂。试剂。n第二代：使用在细菌或真菌中表达的人工重组第二代：使用在细菌或真菌中表达的人工重组或化学合成多肽或化学合成多肽HIVHIV抗原，应用抗原，应用间接法间接法原理检原理检测测HIVHIV抗体。基因重组通常易于在培养基中生抗体。基因重组通常易于在培养基中生产大量同源性抗原，产品为单一目的基因而非产大量同源性抗原，产品为单一目的基因而非多样性抗原混合，多样性抗原混合，特异性特异性高于第一代试剂。高于第一代试剂。用于检测用于检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA法法n第三代：使用合成多肽第三代：使用合成多肽HIVHIV抗抗原（少数用重组抗原），应原（少数用重组抗原），应用用双抗原夹心法双抗原夹心法原理检测原理检测HIVHIV抗体。由于标记抗体。由于标记HIVHIV抗原可同抗原可同时检测血清中时检测血清中HIV-1 IgGHIV-1 IgG、IgMIgM、IgA IgA抗体，此类试剂的抗体，此类试剂的敏感性和特异性敏感性和特异性均优于标记均优于标记抗人免疫球蛋白的间接法。抗人免疫球蛋白的间接法。高纯度的高纯度的HIV-1/-2HIV-1/-2型抗原型抗原待检抗体待检抗体酶标记的酶标记的HIV-1/-2HIV-1/-2型抗原型抗原用于检测用于检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA法法n第四代第四代 此类试剂在第三代试剂盒基础上，此类试剂在第三代试剂盒基础上，将针对将针对P24P24抗原的抗体与抗原的抗体与HIV-1HIV-1抗原一抗原一起包被固相载体，可同时检测起包被固相载体，可同时检测HIV-1 HIV-1 IgGIgG、IgMIgM、IgA IgA抗体和抗体和P24P24抗原。增加抗原。增加了敏感性和特异性了敏感性和特异性 检测检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA试剂试剂n试剂种类试剂种类 必必须须使使用用经经国国家家食食品品药药品品监监督督管管理理局局注注册册批批准准，批批批批检检合合格格的的HIV HIV 抗抗体体检检测测试剂试剂 使使用用在在有有效效期期内内且且保保存存条条件件符符合合要要求求的试剂的试剂n存放试剂的冰箱温度存放试剂的冰箱温度2-82-8，使用前要放，使用前要放置室温平衡置室温平衡检测检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA试剂试剂n完整的完整的ELISAELISA试剂盒包含以下各组分试剂盒包含以下各组分 已包被抗原或抗体的固相载体已包被抗原或抗体的固相载体 酶标记的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体 酶的底物酶的底物 阴性对照品和阳性对照品阴性对照品和阳性对照品 定性测定定性测定 标本（和结合物）的稀释液标本（和结合物）的稀释液 洗涤液洗涤液 酶反应终止液酶反应终止液ELISAELISA检测试剂检测试剂n固相载体固相载体 固相载体材质固相载体材质 聚苯乙烯聚苯乙烯 固相载体形状固相载体形状 微量滴定板微量滴定板 检测检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA试剂试剂n结合物（酶标记的抗体或抗原）结合物（酶标记的抗体或抗原）辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)(horseradish peroxidase,HRP)n底物底物 四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)反应后显蓝色，终止后呈黄色，最适吸收波长反应后显蓝色，终止后呈黄色，最适吸收波长为为450nm450nm 检测检测HIVHIV抗体的抗体的ELISAELISA试剂试剂n洗涤液洗涤液 常用含常用含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸缓冲盐水磷酸缓冲盐水 n终止液终止液 HRP HRP常用强酸，最常见常用强酸，最常见2mol/L2mol/L硫酸硫酸 ELISAELISA试验试验 标本的采取和保存标本的采取和保存 加样加样 孵育孵育 洗涤洗涤 显色与终止显色与终止 酶标仪测定酶标仪测定标本的采取和保存标本的采取和保存n 避免溶血避免溶血 红细胞溶解时会释放出具有过氧化红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以物酶活性的物质，以HRP HRP 为标记为标记 的的ELISA ELISA 测测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色定中，溶血标本可能会增加非特异性显色n 避免污染避免污染 血清标本宜在新鲜时检测。如有细血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性菌污染，菌体中可能含有内源性HRPHRP，也会产，也会产生假阳性反应生假阳性反应n 保存保存 一周内一周内 2 288 一周以上一周以上 -20 -20标本送检标本送检n信息信息 姓姓 名名 n外螺旋盖（带胶垫）血清管外螺旋盖（带胶垫）血清管 n接收样本时，必须填写样本接收记录单接收样本时，必须填写样本接收记录单 建立建立样本的唯一性编码样本的唯一性编码 登记有关信息登记有关信息 受检者姓名、性别、年龄、职业、受检者姓名、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果、送检单位、人群类别、检验结果、送检日期、报告日期送检日期、报告日期 样本的接收样本的接收样本的接收样本的接收n认真核对样本与送检单提供的信息是否相认真核对样本与送检单提供的信息是否相符、样本有无破损和渗漏。如发现渗漏的，符、样本有无破损和渗漏。如发现渗漏的，立即将尚存的样本移出，对样本管及包装立即将尚存的样本移出，对样本管及包装进行消毒，同时报告主管领导和有关专家进行消毒，同时报告主管领导和有关专家n检查样本的物理性状。并做好记录。如果检查样本的物理性状。并做好记录。如果样本不符合试验的要求，应将样本安全废样本不符合试验的要求，应将样本安全废弃，同时立即通知送样人弃，同时立即通知送样人样本的接收样本的接收 实验室工作人员在打开样本容器时，实验室工作人员在打开样本容器时，须小心，防止内容物崩溅。样本处理须小心，防止内容物崩溅。样本处理时，须时，须穿戴防护衣，穿戴防护衣，在生物安全柜中在生物安全柜中操作，同时应戴一次性口罩、防护眼操作，同时应戴一次性口罩、防护眼镜，防止皮肤、粘膜污染。镜，防止皮肤、粘膜污染。用后的包用后的包装要进行消毒装要进行消毒检测方法检测方法n 必必须须按按照照试试剂剂盒盒说说明明书书（sopsop）中中规规定定的的要要求进行操作求进行操作 包包括括进进行行检检测测的的实实验验条条件件如如阳阳性性对对照照和和阴阴性性对对照照的的设设置置、试试剂剂、标标本本加加样样量量、孵孵育时间、反应温度、洗涤程序和次数等育时间、反应温度、洗涤程序和次数等n 标本质量标本质量 冷冷冻冻样样品品实实验验前前需需解解冻冻并并混混匀匀，血血清清或或血血浆浆样样品品如如溶溶血血、微微生生物物污污染染、血血脂脂过过多多以以及黄疸等情况，可能会对试验产生影响及黄疸等情况，可能会对试验产生影响n加样加样 移液器移液器(包括单头和多头移液器包括单头和多头移液器)是实验是实验室中重要的基本器具，一年至少校准一室中重要的基本器具，一年至少校准一次次 准确加到微孔板底部，避免加在孔壁上准确加到微孔板底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，部，并注意不可溅出，不可产生气泡，加入后及时放入孵箱加入后及时放入孵箱检测方法检测方法检测方法检测方法n孵育孵育 孵育的温度要控制好，时间要掌握好，严格按孵育的温度要控制好，时间要掌握好，严格按照说明书操作照说明书操作 注意封板，避免蒸发注意封板，避免蒸发 反应板不宜叠放，反应板至水面下的反应板不宜叠放，反应板至水面下的1/31/3处，处，以保证各板的温度都能迅速平衡，保证温度以保证各板的温度都能迅速平衡，保证温度的均一性的均一性检测方法检测方法n洗涤洗涤 各种试剂盒的洗液不要混用。按要求稀释，各种试剂盒的洗液不要混用。按要求稀释，洗液如果结晶应待其融解后配制洗液如果结晶应待其融解后配制 检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象象 按孔的大小调节好洗液的量按孔的大小调节好洗液的量 孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡 检测方法检测方法n显色与终止显色与终止 显色剂不用过期显色剂显色剂不用过期显色剂 加终止液时应避免产生气泡。如产生较多加终止液时应避免产生气泡。如产生较多气泡，则会导致假阳性气泡，则会导致假阳性 n酶标仪测定酶标仪测定n 每天（每次）每天（每次）核对酶标仪滤光片波长核对酶标仪滤光片波长 查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象n 每周每周 清洁仪器表面，保护光学零件，不沾灰尘清洁仪器表面，保护光学零件，不沾灰尘n 每月每月 洗洗涤涤时时检检查查各各孔孔是是否否与与相相应应的的冲冲洗洗头头对对位位良良好好，负负压压是是否否符符合合规规定定要要求求，这这是是保保证证各各孔孔洗洗涤涤均均衡衡一一致的前提致的前提ELISA ELISA 洗板机与酶标仪洗板机与酶标仪(推荐方法推荐方法)结果报告结果报告n分析结果及发出检测报告前，应在分析结果及发出检测报告前，应在试剂盒试剂盒和外部质控品结果满足要求的前提下和外部质控品结果满足要求的前提下，对，对样品进行分析，试剂盒及外部质控品不合样品进行分析，试剂盒及外部质控品不合格，样品需要重新检测，复核人对检测结格，样品需要重新检测，复核人对检测结果进行仔细复核并对结果提出结论，签发果进行仔细复核并对结果提出结论，签发人对试验结论进行审核、分析、总结、签人对试验结论进行审核、分析、总结、签字字 结果报告结果报告n筛查阴性样本，出具具有法律效用的正式报告筛查阴性样本，出具具有法律效用的正式报告,血清建议保存血清建议保存1-21-2个月个月n筛查阳性样本，及时送确证实验室。必要时可出筛查阳性样本，及时送确证实验室。必要时可出具具HIVHIV抗体待复查报告抗体待复查报告n筛查实验室不得保存阳性样本，需转运至确认实筛查实验室不得保存阳性样本，需转运至确认实验室验室n筛查实验室不可以出具筛查实验室不可以出具HIVHIV抗体阳性报告抗体阳性报告结束语结束语n严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证的仪器是保证ELISAELISA必要条件必要条件n严格遵照规定操作，必能得出准确的结果严格遵照规定操作，必能得出准确的结果