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生物化学与分子生物学实验技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、第三章:层析技术第三章:层析技术第三章第三章 层析技术层析技术第1页 层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质(分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)不一样,使各组分以不一样程度分布在固定相和流动相中,当流动相流过固定相时,各组分以不一样速度移动,而到达分离技术。层析技术操作简便,样品可多可少,既可用于试验室研究工作,又可用于工业生产,还可与其它分析仪器配合,组成各种自动分析仪器。第2页层析技术分类 (1)按流动相状态分类:用液体作为流动相称为液相层析,或称液相色谱;以气体作为流动相称为气相层析,或称气相色谱。(2)按固定相使用形式分类:可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈
2、钢管中组成层析柱)、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。(3)按分离过程所主要依据物理化学原理分类:可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。本章按第三种分类进行叙述。第3页第一节 吸附层析 吸附层析是利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样而使混合物中各组分分离方法。吸附层析在各种层析技术中应用最早,因为吸附剂起源丰富,价格低廉,易再生,装置简单,又含有一定分辩率等优点,故至今仍广泛使用。第4页 凡能够将其它物质聚集到自己表面上物质,都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面物质称为被吸附物。在吸附层析中应用吸附剂普通为固体。固体内部分子所受分子间作用力是对称,而固体表面分子所受力是不对称
3、。向内一面受内部分子作用力较大,而表面向外一面所受作用力较小,因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。吸附剂与被吸附物分子之间相互作用是由可逆范德华力所引发,故在一定条件下,被吸附物能够离开吸附剂表面,这称为解吸作用。吸附层析就是经过连续吸附和解吸附完成。本节主要介绍吸附柱层析和聚酰胺薄膜层析,薄层吸附层析将在本章第六节介绍,气固吸附层析在第七节介绍。第5页一、吸附柱层析 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中,组成层析柱,层析时欲分离样品自柱顶加入,当样品溶液全部流入吸附层析柱后,再加入溶剂冲洗。冲洗过程称为洗脱,加入溶剂称为洗脱剂。第6页第7页 在洗脱
4、过程中,柱内不停地发生解吸、吸附,再解吸、再吸附过程。即被吸附物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动,又碰到新吸附剂颗粒被再吸附,后面流下溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后,该物质会向下移动一定距离。此距离长短与吸附剂对该物质吸附力以及溶剂对该物质解吸(溶解)能力相关。不一样物质因为吸附力和解吸力不一样,移动速度也不一样。吸附力弱而解吸力强物质,移动速度就较快。经过适当时间以后,不一样物质各自形成区带,假如被分离是有色物质话,就能够清楚地看到色带(色层)。假如被吸附物质没有颜色,可用适当显色剂或紫外光观察定位,也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当显色剂或紫外光检测,以洗脱液体积对被洗
5、脱物质浓度作图,可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败关键是选择适当吸附剂、洗脱剂和操作方式。第8页(一)吸附剂选择 惯用吸附剂有极性和非极性两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者,活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型吸附剂,都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。在选择详细吸附剂时,主要是依据吸附剂本身和被吸附物质理化性质进行。普通来说,极性强吸附剂易吸附极性强物质,非极性吸附剂易吸附非极性物质。不过为了便于解吸附,对于极性大分离物,应选择极性小吸附剂,反之亦然。理想吸附剂必需经过屡次试验才能取得。第9页1.羟基磷灰石 羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2,简称H
6、A吸附容量高,稳定性好(在T85,pH5.5-10.0均可使用),所以在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等,经过一次HA柱层析,就能到达有效分离。HACa2+基团和生物分子表面负电荷基团相互反应,在用HA分离生物分子过程中起着主要作用。而HAPO43-基团与生物分子表面正电荷基团相互反应,则仅起着次要作用。第10页使用HA作为固定相基质注意事项:(1)HA系干粉时,要先在蒸馏水中浸泡,使其膨胀度(水化后所占有体积)到达2-3mL/克后,再按16体积加入缓冲液悬浮,以除去细小颗粒;(2)HA悬
7、浮液须用旋涡振荡器混合,若用磁棒或玻棒搅拌时,HA晶体结构会被破坏;(3)忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5缓冲液。当用过HA层析柱再生时,要先挖去顶部一层HA,然后用一倍床体积1mol/L NaCl溶液洗涤,接着用4倍床体积平衡液洗涤平衡,如此处理后即可使用;(4)就操作容量来说,普通细颗粒HA比粗大。而从分辨率比较,粗颗粒HA也没有细好。用细颗粒HA层析时,柱子直径应大些才能到达满意流速。第11页2.硅胶 是最惯用吸附剂,通惯用SiO2.xH2O表示,是含有硅氧交联结构,表面有许多硅醇基多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强吸附力。水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活
8、性,经加热可被除去水称自由水,若自由水含量达17%以上,则吸附力极低,此时,硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热30min,吸附能力显著增强,这一过程称为活化。假如将硅胶加热到500,硅醇基结构会变成硅氧烷结构,吸附能力显著下降。硅胶含有微酸性,适合用于分离酸性和中性物质,如有机酸、氨基酸、甾体等。第12页3.氧化铝 分酸性、碱性和中性三种,酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物,碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物,中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定甙类、酯类等化合物。氧化铝用前也需脱水活化,通常于400高温下加热6h,使氧
9、化铝含水量在0%-3%之间,可得到级或级氧化铝,但温度过高也会破坏氧化铝内部结构。4.大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成份分离。第13页(二)洗脱涤选择 洗脱剂指是溶解被吸附样品和平衡固定相溶剂。适当洗脱剂应符合以下条件:纯度较高;稳定性好;能较完全洗脱所分离成份;黏度小;易和所需要成份分开。第14页 洗脱剂可依据分离物中各成份极性、溶解度和吸附剂活性来选择。普通蛋白质或核酸被极性强羟基磷灰石吸附后,要用含有盐缓冲液洗脱。而甾体或色素等化合物被极性较弱硅胶吸附后,则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂浓度大小和极性强弱选择,需经过试验确定。在实践中,选择洗脱剂次序是由极性小到极性大(正向层析)。当
10、把极性小洗脱剂换成极性大时,宜先将极性大和极性小洗脱剂混合使用,浓度则由低到高。总之,选取洗脱剂标准是能较完全地洗脱所要分离成份,并力争用量少、洗脱时间短。第15页(三)操作 柱层析设备主要有层析柱、部分搜集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时,配置一台检测仪和一台统计仪就组成一个完整层析系统。1.层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板玻管。柱直径与长度之比,普通为110-140。采取极细吸附剂装柱时,宜用百分比大层析柱。反之,则宜用百分比小层析柱。这么有利于节约时间和提升分辨率。层析柱床体积是由吸附剂量和膨胀度决定。第16页2.吸附剂用量 吸附剂用量是依据其本身操作容量和分离物中各成份性质决定。当
11、操作容量高时,吸附剂用量少。普通吸附剂用量为被分离样品30-50倍。若样品中各成份性质相同难以分开时,则吸附剂用量应增大,有时大于样品100倍 第17页3.装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱方法分干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中,然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内,排走其中空气,然后把预先用溶剂浸泡好吸附剂搅匀,随即将此悬浮液连续倾入柱中,待其自然沉降至柱高1/4-1/3时打开柱下端口,让溶剂慢慢流出,使柱上端悬浮液渐渐下降至需要高度。吸附剂表面要平整,应使其一直浸没在溶剂中,严防气泡产生。这种装柱法对各种基质都适用。装好层析柱应马上与洗脱
12、剂连接,在一定操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间压力差),控制其流速,让2-3倍柱体积洗脱剂流过固定相,使其到达平衡,也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡标准。第18页4.上样和洗脱 经过平衡层析柱,当平衡液流到与固定相表面一致位置时,用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面,要尽可能防止冲动基质。加入样品液体积普通应小于床体积1/2(当加入样品量相同时,体积越小越有利于提升分辨率)。待样品液液面流到固定相表面时,用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面高度约5厘米计),并在柱上端与装有洗脱剂贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分搜集器
13、接通,马上进行分级搜集(按体积或时间分管搜集)。随即将搜集每管溶液进行浓度或活性测定。依据测定结果,即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标,以每管溶液中样品浓度或活性为纵坐标,有适当检测器和统计仪时,洗脱液流经检测器再搜集,用统计仪可自动绘制洗脱曲线。第19页 理想洗脱曲线如图3-1所表示。图中A峰和B峰均呈对称形,二者没有重合,这表明样品液中组分已完全分开。层析峰面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物依据。第20页 为了取得满意分离结果,洗脱液流速务必恰当控制。假如太快,洗脱物在两相中平衡过程不完全;假如太慢,洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重合,宜降低洗
14、脱剂强度,若峰间距离过大,或一些成份不能洗脱时,宜加大洗脱剂强度(极性),成份复杂时,可采取洗脱剂由弱到强梯度洗脱(方法见离子交换层析)。由层析柱分离出样品经浓缩或冻干处理后,可进行纯度测定。如杂质含量仍大时,应该用其它方法继续纯化。第21页二、聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜(尼龙薄膜)层析是指样品溶液随流动相经过聚酰胺薄膜时,因为聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力不一样,而将各组分分离方法。聚酰胺是由己二酸与己二胺聚合而成或由己内酰胺聚合而成高分子化合物。含有大量酰胺基团,其羰基可与含羟基物质形成氢键,其亚氨基又可与硝基化合物或醌类形成氢键,而产生吸附作用。不一样物质因为形成氢键能力不一样,故吸
15、附力也不一样,经过吸附和洗脱就可到达分离目标。第22页 聚酰胺薄膜层析只适合用于极性分子分离。如,酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸类物质等。尤其是在蛋白质化学结构分析中,氨基酸衍生物,如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等分析,灵敏度高,分辨力强,操作方便,速度较快。洗脱时,洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键,而使被吸附物解吸。各种化合物与聚酰胺形成氢键能力主要由物质分子结构所决定。另外也与所使用溶液相关。普通用水作溶剂时形成氢键能力最强,故轻易吸附,难于洗脱。在有机溶剂中形成氢键能力较弱,在碱性溶液中形成氢键能力最弱,所以洗脱剂最好选取碱性溶液,如二甲
16、基甲酰胺(DMF)溶液、稀氢氧化钠溶液或稀氨水等。第23页第二节 分配层析 分配层析是利用各组分分配系数不一样而给予分离方法。分配系数(K)是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶解到达平衡时,该溶质在两相溶剂中浓度比值:K=固定相中溶质浓度/流动相中溶质浓度 分配系数与溶剂和溶质性质相关,同时受温度、压力影响。所以不一样物质分配系数不一样。而在恒温恒压条件下,某物质在确定层析系统中分配系数为一常数。在分配层析中,通惯用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一个溶剂作为固定相,另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂沿固定相流动组成流动相,某溶质在流动相带动下流经固定相时,会在两相间进行连续动态分配。当样品中含有
17、各种分配系数各不相同组分时,分配系数越小组分,随流动相迁移越快。两个组分分配系数差异越大,在两相中分配 次数越多,越轻易被彻底分离。第24页 纸层析属于经典分配层析,且系统简单,使用方便,在生物化学发展中发挥过极其主要作用。本节主要经过纸层析介绍分配层析基本知识。另外,将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可组成薄层层析系统,因为薄层层析还可做吸附、离子交换等层析,将在本章第六节专门叙述,在硅藻土上吸附或化学键合一定溶剂,装到层析柱上,以气体为流动相可组成气液分配层析,即气相色谱系统,在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定溶剂,装到层析柱中,用一定洗脱剂洗脱,可组成液液分配层析,这种系统在高
18、效液相色谱中应用普遍。气相色谱和高效液相色谱系统复杂,将在本章第七节和第八章专门介绍。第25页二、纸层析(一)原理 滤纸普通能吸收22%-25%水,其中6%-7%水是以氢键与滤纸纤维上羟基结合,普通情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维结合水为固定相,而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时,有机溶剂在滤纸上流动,样品中各物质在两相之间不停地进行分配。因为各物质有不一样分配系数,移动速度所以不一样,从而到达分离目标。第26页 溶质在滤纸上移动速率可用Rf值表示:Rf=a/b式中a:溶质斑点中心移动距离 b:溶剂前沿移动距离 Rf值决定于被分离物质在两相间分配系数以及两相间体
19、积比。因为在同一试验条件下,两相体积比是一常数,所以Rf值决定于分配系数。不一样物质分配系数不一样,Rf值也不相同,由此能够依据Rf值大小对物质进行定性分析。第27页(二)影响Rf值主要原因 1.1.物质结构和极性物质结构和极性 物质结构和分子极性是影响Rf值主要原因。极性较大物质,在水中溶解度较大,其Rf值就较小,反之亦然。2.2.滤纸滤纸 不一样滤纸厚薄程度和纤维松紧度各不相同,所以结合水量不一样,两相体积比也就不一样。所以同一个物质在不一样型号滤纸上进行层析时,所得到Rf值也不相同。另外,滤纸上所含杂质也会影响Rf值,必要时要进行预处理,以去除杂质影响。比如:可用0.01-0.4mol/
20、LHCl处理滤纸,以除去滤纸上金属离子,然后再用水洗至中性。层析滤纸由高纯度棉花制成。要求质地均一,厚薄一致,纤维松紧度适中,含有一定机械强度,并含有一定纯度。国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采取。第28页3.层析所用溶剂 同一物质在不一样溶剂系统中进行层析时,Rf值不一样。所以溶剂配制和使用必须严格,才能使Rf值重现性好。在好溶剂系统中被分离物质Rf值应在0.05-0.85之间,样品中被分离组分Rf之差最好大于0.05。溶剂系统中试剂若纯度不够,需经过预处理后才能使用。处理方法因溶剂性质而异。常用处理方法有:酸、碱抽提,水洗涤,重蒸馏,脱水干燥等。举比如下:(1)苯酚:重蒸馏,收集180
21、馏分。(2)乙酸:在冰醋酸中加入1%重铬酸钾,蒸馏,收集118馏分。(3)正丁醇:先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氢氧化钠溶液洗涤,再用无水碳酸钾脱水,用磨口蒸馏器蒸馏,收集117馏分。第29页4.pH4.pH值值 溶剂和样品pH值会影响物质解离,从而影响物质极性和溶解度,使Rf值改变。溶剂酸碱度增大则流动相含水量增高,使极性物质Rf值增加;反之则降低。为了防止或降低pH值对Rf值影响,可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理,使之保持一定pH值,经过调整溶剂或样品溶液pH值,使pH值保持恒定。5.5.温度温度 温度能影响物质在两相中溶解度,即影响分配系数;也影响滤纸纤维水合作用,即影响固定相
22、体积;同时在多元溶剂系统中,温度显著地影响溶剂系统含水量,即影响流动相组分百分比。所以温度改变使Rf值改变很大,为此,层析必须在恒温条件下进行。一些对温度敏感溶剂系统,最好不要配成饱和溶液。如水饱和酚溶液,可改成酚水 41或51等。第30页6.6.展开方式展开方式 同一物质在其它层析条件完全相同情况下,用不一样展开方式进行层析时,所得到Rf 值不相同。用下行法展开时,Rf值较大;用上行法展开时,Rf值较小;用圆形滤纸层析时,因为内圈较外圈小,限制了溶剂流动,Rf值也较小。7.7.样品溶液中杂质样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时,有时对Rf值有所影响。比如:氯化钠存在会影响氨基酸Rf 值。第3
23、1页(三)操作方法 1.1.样品处理样品处理 用作纸层析样品,应尽可能除杂纯化。调整到一定pH值,浓度太低可用真空浓缩提升浓度,浓度太高则需稀释。2.2.点样点样 将滤纸裁成适当大小,用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线),线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管,定量分析需用血球计数管或微量注射器)轻轻点在原点上。样品点直径约0.3-0.5cm。点样量应依据纸长短以及样品性质来决定,普通每一样品量为5-30g。点样普通采取少许屡次,每点一次必须用冷风吹干,然后再点第二次。每次点样位置应完全重合,不然会出现斑点畸形现象。第32页3.3.平衡平衡 点样以
24、后展开以前先将滤纸与层析缸用配好溶液系统蒸汽来饱和,这个过程称之为“平衡”。若不经平衡,滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和,在层析过程中,滤纸会从溶剂中吸收水分,溶剂也会从滤纸表面挥发,从而改变溶剂系统组成,严重时纸上会出现不一样水平溶剂前沿,严重影响层析效果。平衡普通在密闭层析缸内进行。第33页4.4.展开展开 平衡结束后,将滤纸靠样品点一端浸入溶剂中,溶剂液面距原线距离约1cm,此时即开始展开。当溶剂前沿抵达滤纸另一端0.5-1cm处时,展开结束,取出滤纸,在溶剂前沿处做一标识,晾干或用冷风吹干。按溶剂在滤纸上流动方向不一样,展开有上行、下行和环行三种方式。(1)上行法:将滤纸点样一端向下浸入溶
25、剂中,溶剂因毛细管引力作用从下向上流动。上行法操作简单,重现性好,是最惯用展开方法,但展开时间较长。(2)下行法:在层析缸上部有一盛展开剂液槽,将滤纸点样一端朝上浸入槽中,溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快,但Rf值重现性较差,斑点易扩散。第34页 (3)环行法:又称水平法,样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右环形线(原线)上。滤纸水平放置,溶剂由滤纸条引向圆心,然后不停向四面水平方向流动。因为溶剂向圆周方向扩散,所以展开图谱呈弧形。用环行法展开时,最好使用无方向性特制滤纸。如东洋51UH滤纸等。(4)双向展开法:假如样品组分较多,用一个溶剂系统(常为酸性)不能将各组分全部分开时,可
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