甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析.pdf

激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.5Oct.2023第 32 卷第 5 期2023 年 10 月收稿日期：2023-06-06;修回日期：2023-08-29。基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目（2019MS08155）；内蒙古医科大学大学生创新创业训练计划项目（202210132063）；内蒙古医科大学大学生科技创新“英才培育”项目（YCPY2023104）。*通信作者：陈丽琴，教授，硕士研究生导师，从事法医遗传学和法医病理学研究，E-mail:；王亚丽，实验师，主检法医师，从事法医遗传学和法医病理学研究，E-mail:。甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的 比较分析黄静1，李琪睿1，李禹泽1，宋海迪1，刘安琪1，宋振祥2，赵晋远1，宣宇佳1，白慧茹1，霍志鑫1，易新容1，顾捷1，王亚丽1*，陈丽琴1*（1.内蒙古医科大学基础医学院法医学实验室，呼和浩特 010030；2.内蒙古医科大学附属医院心脏大血管外科，呼和浩特 010030）摘要：本研究以10例甲醛固定石蜡包埋组织（FFPET）作为疑难检材，将其制成蜡膜，分别以二甲苯-Chelex100法、脱蜡液-Chelex100法、脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒（简称FP试剂盒）、脱蜡液-北京天根石蜡包埋组织基因组提取试剂盒法（简称天根试剂盒）提取DNA，进行紫外分光光度计测定（浓度、纯度）及短串联重复序列（STR）分型检测（23个常染色体），通过比较分析FFPET在4种不同提取方法中的提取质量、STR分型质量和检出率，从而寻求一种高效简便、经济实用、方便快捷的甲醛固定石蜡包埋组织中DNA提取方法。结果表明：应用4种方法提取的石蜡包埋组织蜡膜DNA经紫外分光光度计测定后显示，应用2种Chelex100法提取的DNA浓度高于2款试剂盒，试剂盒提取的DNA的纯度优于另外2种方法，以上差异均具有统计学意义（P0.05）；STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之间的扩增不均衡，呈现前高后低状态；STR平均检出率为FP试剂盒 天根试剂盒 Chelex100法，2种Chelex100法STR基因座检出率比较无显著差异（P0.05），但分别和另外2种方法试剂盒方法相比有显著差异（P0.05），FP试剂盒和天根试剂盒法相比有显著差异（P0.05）。因此，在涉及甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难检材的法医DNA鉴定案件时，脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒法优于其余3种提取DNA方法。关键词：甲醛固定石蜡包埋组织；法医检材；疑难检材；方法比较中图分类号：DF795.2 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.007A Comparative Analysis of Four Different DNA Extraction Methods from Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue in Forensic MedicineHUANG Jing1,LI Qirui1,LI Yuze1,SONG Haidi1,LIU Anqi1,SONG Zhenxiang2,ZHAO Jinyuan1,XUAN Yujia1,BAI Huiru1,HUO Zhixin1,YI Xinrong1,GU Jie1,WANG Yali1*,CHEN Liqin1*(1.Department of Forensic Medicine,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010030,China;2.Department of Cardiovascular Surgery,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010030,China)Abstract:The study used myocardial tissues of 10 forensic FFPET patients and the samples were prepared into films.The DNA was extracted using xylene-Chelex100 method,dewaxing solution-Chelex100 method,dewaxing solution-Vazyme Fast-激光生物学报442第 32 卷甲醛固定石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded tissue，FFPET）是法医鉴定中重要的存档材料，可用于个人识别、亲权鉴定、分子诊断以及一些案例的回顾性分析，在医疗纠纷及诈保案等案件鉴定中有时作为唯一的生物样本。由于受到多种化学物理因素的影响，FFPET的DNA易断裂、DNA蛋白质交联1-4造成生物检材的高度降解，从而导致DNA提取比较困难；此外，DNA蛋白的交联作用会抑制DNA聚合酶活性从而影响PCR扩增，同时石蜡会阻碍组织的消化和DNA的释放，这些因素均会影响DNA的提取。1985年Goelz等 1 最先提出石蜡包埋组织提取技术，即为经典的提取方法酚氯仿抽提法；Howe等5提出氯化钠盐析法提取石蜡包埋组织，其方法操作简单、速度快，造价低，而且不需要接触酚、氯仿等有毒化学品。水煮法、微波法、单纯消化法早年应用较多，但各有优缺点6。近年来，各类石蜡提取DNA的商品化试剂盒被开发出来，应用较广且提取效果较好的是Qiagen的QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒，但价格昂贵，其他的如北京天根提取试剂盒、湖南圣湘提取试剂盒等应用也较多7。基于FFPET的高度降解、石蜡的影响因素，且考虑到二甲苯脱蜡的高效性和其自身具有的毒性8-9，我们选取了4种不同的提取甲醛固定石蜡包埋组织DNA方法进行比较分析，寻求一种高效简便、经济实用、方便快捷的DNA提取方法。1材料与方法1.1样本本研究样本为收集于4例案件的10份不同部位的甲醛固定石蜡包埋心肌组织，均为内蒙古医科大学司法鉴定中心法医病理鉴定室近半年存档的标本材料，且选取的样本非肿瘤组织、无明显自溶，具体信息见表1。将石蜡组织制作成厚度为10 m每张的蜡膜组织，每5张为一组。1.2主要试剂与仪器 无水乙醇（光华科技有限公司，广东），二甲苯（科密欧化学试剂有限公司，天津），格林GS脱蜡液（格林标本技术开发有限公司，哈尔滨），Chelex100（Bio-RAD公司，美国），蛋白酶K（10 mg/L）（Pro-mega公司，美国），二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）（百奥莱博科技有限公司，北京），Vazyme Fast-Pure FFPE DNA Isolation试剂盒（Vazyme公司，南京），北京天根石蜡包埋组织基因组提取试剂盒（天根生化科技公司，北京），Verifiler Plus Early Access试剂盒（Thermo Fisher公司，美国），Hi-Di formamide（Thermo Fisher公司，美国）。RM2255切片机（徕卡公司，德国），H203-H型恒温金属浴（卡尤迪生物科技有限公司，北京），NanoDropND-2000c型紫外分光光度计（Thermo Fisher公司，美国），9700 型PCR扩增仪（Thermo Pure FFPE DNA Isolation kit(abbreviated as FP kit)and dewaxing solution-Beijing Tiangen paraffin-embedded tissue genome extraction kit(abbreviated as Tiangen kit),and determined by ultraviolet spectrophotometer for concentration and purity,and short tandem repeats(STR)typing test(23 autosomes).The extraction quality,STR typing quality and detection rate of FFPET in four different extraction methods were compared and analyzed to find an efficient,simple,economical,practical,and conve-nient method.The results showed that for the quality of extrated DNA,the concentration of DNA extracted by two Chelex100 methods were higher than the two test kits,and the purity of DNA extracted by the kits were superior to that of the other two methods.The differences were statistically significant(P0.05).For the quality of STR typing and detec-tion rate,STR typing generally shows the imbalance of amplification between different loci and different alleles of the same lo-cus,with the former being higher and the later lower.The average detection rate of STR was in the order of:FP kit Tiangen kitChelex100 method.There were no significant difference in the detection rates of STR loci between the two Chelex100 methods(P0.05),whereas there were significant differences between them and the other two methods(P0.05).There was a significant difference between the FP kit and Tiangen kit(P0.05).Therefore when dealing with difficult samples such as formaldehyde-fixed paraffin-embedded tissues in forensic DNA identification cases,the dewaxing solution-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation kit was superior to the other three DNA extraction methods.Key words:formalin-fixed paraffin-embedded tissue;forensic examination materials;difficult inspection materials;method comparison （Acta Laser Biology Sinica,2023,32(5):441-449）443第 5 期Fisher公司，美国），3130型遗传分析仪（Thermo Fish-er公司，美国）。1.3DNA提取及定量1.3.1DNA提取脱蜡液-Chelex100 法：向 1.5 mL装有 5 张10 m厚蜡膜的EP管中加入 1 mL脱蜡液溶液，37金属浴10 min，13 000 r/min离心15 min，小心吸去弃掉脱蜡液；加入 1 mL无水乙醇洗涤，上下颠倒3 min,13 000 r/min离心15 min，弃去无水乙醇（重复该步骤23次）；室温开盖放置直至残留乙醇挥发完全；加入200 L的5%Chelex100、10 L的20 mg/mL的蛋白酶K和10 L的1 mol/L的DTT，56孵育过夜；98煮沸8 min，13 000 r/min离心3 min，上清液即为提取的DNA。二甲苯-Chelex100 法：向 1.5 mL装有 5 张10 m厚蜡膜的EP管中加入1 mL二甲苯溶液，后续操作步骤同脱蜡液-Chelex100法。天根试剂盒法：根据天根试剂盒说明书操作。1）将5张10 m厚蜡膜装于1.5 mL无菌离心管中，加入500 L裂解液GL，再加入50 L缓冲液GP，剧烈涡旋10 s。2）98孵育30 min，期间颠倒混匀3次，直至样品完全溶解，12 000 r/min离心5 min。3）使用200 L枪头沿管壁小心吸取中间层的水相清液于新的离心管中。4）加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，静置3 min。5）将上一步所得的混合液加入一个吸附柱CR2 中，8 000 r/min室温离心 2 min，倒掉收集管中的废液，重新将吸附柱放回收集管中。6）向吸附柱CR2中加入500 L缓冲液GD，8 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。7）向吸附柱CR2中加入600 L漂洗液PW，8 000 r/min室温离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。8）重复第7步。9）将吸附柱CR2放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液。10）将吸附柱开盖置于室温放置25 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11）将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 65预热的30100 L洗脱缓冲液TE洗脱，室温放置25 min，12 000 r/min离心2 min，将收集有DNA的离心管-20保存。FP试剂盒法：根据FP试剂盒说明书操作。1）加入0.6 mL Deparaffinization Solution至样品中，剧烈涡旋 5 s，短暂离心让样品浸泡到脱蜡液中，56水浴6 min，剧烈涡旋20 s。2）14 000 r/min离心2 min，弃上清。3）加入200 L Buffer FTL和20 L Proteinase K工作液至样品中，涡旋混匀，56水浴1 h至样品完全消化，其间需颠倒混匀数次。4）90水浴1 h。5）加入200 L Buffer FL和200 L无水乙醇至上述处理液中，涡旋混匀15 s。6）将FFPE DNA吸附柱置于收集管中，转移混合液至吸附柱中，10 000 r/min离心60 s。7）弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入500 L Buffer FW1（已加入乙醇）至吸附柱，10 000 r/min离心60 s。8）弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入650 L Buffer FW2（已加入乙醇）至吸附柱，10 000 r/min离心60 s。9）弃滤液，将吸附柱置于收集管中，10 000 r/min离心空柱3 min。10）将吸附柱转移至新的1.5 mL离心管中，开盖3 min（挥发乙醇），加入1550 L Elution Buf-fer至吸附柱膜中央，室温静置1 min，10 000 r/min离心1 min。11）丢弃吸附柱，将DNA保存于-20。1.3.2DNA定量通过紫外分光光度计进行DNA定量，测定其质量浓度和纯度，其纯度用OD260 nm/OD280 nm来表示。1.4PCR扩增和电泳分型PCR扩增：采用 10.0 L标准反应体系，Veri-filer Plus Early Access试剂盒体系组成包括5PCR Master Mix 2.5 L，10Primer Set 1.0 L，DNA模板1.0 L，去离子水5.5 L。采用标准品007作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。页眉文章标题黄静等：甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析黄静等：甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析表110份甲醛固定石蜡包埋组织样本信息表Tab.1The information table of 10 formaldehyde fixed paraffin embedded tissue samplesSample number Case number Gender Age Organization type8-YS20238Male56Left ventricle8-ZS20238Male56Right ventricle8-G20238Male56Interventricular septum8-XJ20238Male56Apex of heart9-ZS20239Male28Left ventricle9-G20239Male28Interventricular septum9-YS20239Male28Right ventricle10-ZS202310Male7Left ventricle10-G202310Male7Interventricular septum10-XJ202310Male7Apex of heart激光生物学报444第 32 卷PCR条件：95预变性1 min；96变性10 s，62退火90 s，2个循环；96变性10 s，59退火90 s，27个循环；68终延伸5 min；4保温。电泳分型：扩增好的PCR产物变性后在3130型遗传分析仪上进行毛细管电泳，体系为9.8 L甲酰胺，0.2 L分子量内标LIZ600，1.0 L的PCR产物；用Gene Mapper ID-X软件对23个常染色体STR基因座进行分型。1.5统计学处理对各组样本DNA质量和STR基因座检出情况应用SPSS25.0软件进行配对t检验，P0.05为有统计学差异。2结果与分析2.1提取DNA质量应用 4 种DNA提取法得到的DNA质量浓度均大于 10 ng/L，其中二甲苯-Chelex100 法提取的DNA平均质量浓度最高，天根试剂盒法提取的DNA平均质量浓度最低，脱蜡液-Chelex100法提取的DNA平均质量浓度高于FP试剂盒法。应用4种DNA提取法得到的DNA平均纯度均大于0.60，其中2款试剂盒法由于对DNA进行纯化，因此DNA平均纯度大于1.40，高于2种Chelex100法提取的DNA纯度。脱蜡液-Chelex100法提取的DNA平均纯度最低，为0.740.09；FP试剂盒法提取的DNA平均纯度最高，为1.830.08，具体信息见表2。应用2种Chelex100法提取的DNA平均质量浓度高于2款试剂盒，试剂盒提取的DNA的平均纯度优于另外2种方法，以上差异均具有统计学意义（P0.05）。FP试剂盒提取DNA平均质量浓度和纯度均优于天根试剂盒，此结果无显著性差异（P 天根试剂盒 二甲苯-Chelex100法 脱蜡液-Chelex100法。2种Chelex100法STR基因座检出率比较无显著差异（P0.05），但分别和另外2种试剂盒法相比有显著差异（P0.05）；FP试剂盒和天根试剂盒法相比有显著差异（P0.05）。2.3耗时、成本、环保对比分析从耗时上分析，Chelex100法提取DNA涉及到孵育过夜，用时最长；天根试剂盒用时最短，为90 min。从成本上分析，Chelex100法成本最低，FP试剂盒成本约为天根试剂盒的1.5倍以上，成本较高。从环保角度分析，脱蜡液比二甲苯脱蜡液脱蜡更环保；FP和天根试剂盒法用于脱蜡的试剂未涉及到二甲苯，此法较二甲苯脱蜡更环保。具体信息见表3。3讨论FFPET是法医鉴定中重要的存档材料，中性甲表24种DNA提取法的DNA平均质量浓度和纯度表（n=10）（xs）Tab.2The table of average DNA concentration and purity for four DNA extraction methods（n=10）（xs）Extraction methodsConcentration/(ngL-1)OD260 nm/OD280 nmXylene-Chelex100508.78152.630.770.07Dewaxing solution-Chelex100467.59140.960.740.09Tiangen kit26.7210.371.660.25FP kit70.1053.431.830.08445第 5 期图1二甲苯-Chelex100提取DNA后STR分型图谱（8-GE-L-CE）Fig.1STR typing of DNA extraction with xylene-Chelex 100(8-GE-L-CE)图24种DNA提取法的STR基因座检出率Fig.2Detection rates of STR loci using four DNA extraction methods 页眉文章标题黄静等：甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析黄静等：甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析激光生物学报446第 32 卷图3FP试剂盒提取法STR分型完整图谱（10-G-L-FP）Fig.3Complete STR typing obtained from DNA extraction with FP kit(10-G-L-FP)表34种DNA提取法的耗时、成本、环保信息表Tab.3The table of time,cost,and environmental information of four DNA extraction methodsDNA extraction methodsTimeCostEnvironmental informationXylene-Chelex1001 h pretreatment and overnight6.0 yuan per sampleNoDewaxing solution-Chelex1001 h pretreatment and overnight6.0 yuan per sampleYesFP kit2 h 16 min33.6 yuan per sampleYesTiangen kit1 h 30 min19.6 yuan per sampleYes醛是福尔马林固定液中的主要成分，能够保持人体死后组织细胞的完整性,固定组织的同时对 DNA分子产生不利，DNA分子呈可逆性羟甲基化，并与蛋白质交联后形成稳固的复合物，不利于DNA的提取10-12；甲醛在空气中易氧化成甲酸，甲酸对DNA有较强的降解作用；此外，石蜡组织经过多种447第 5 期理化因素作用后，组织细胞内的DNA脆性增加，使其在提取过程中更容易断裂，导致DNA提取比较困难13。因此，探索该类型组织样本适宜的DNA提取方法很有意义。有研究表明，切片太薄容易将DNA片段切断，不利于大片段DNA的提取，太厚会增加PCR反应的抑制物，不利于后续PCR扩增，切片厚度为10 m时提取的DNA质量更高11-13。因此，本研究用到的石蜡切片的厚度为每张10 m的蜡膜组织，每5张为一组，有利于提取出质量较高的DNA。FF-PET DNA提取包括脱蜡、消化和纯化这3个过程。有机溶剂二甲苯对试验者身体有危害，同时对环境有污染15，17，因此本研究中4种DNA提取法用到非二甲苯和二甲苯脱蜡法。通过比较发现，同样应用Chelex100法进行提取DNA，二甲苯和非二甲苯环保型脱蜡液的脱蜡效果相当，因此，在脱蜡环节上，可使用环保脱蜡液代替二甲苯脱蜡。Chelex100是一种金属离子螯合剂，能与镁、钙等核酸反应生成必需的二价金属阳离子螯合，从而保护DNA，并减少由降解的DNA片段形成的杂带，从而提高PCR反应阳性率及重复率13，15。Che-lex100法是法医物证生物检材DNA提取最常用的图4脱蜡液-Chelex100提取法STR检出率最低的样本图谱（8-Z-L-T）Fig.4STR typing with the lowest STR detection rate using the extraction method of dewaxing solution-Chelex100(8-Z-L-T)页眉文章标题黄静等：甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析激光生物学报448第 32 卷 图5天根试剂盒提取法STR样本图谱（tg-8-L-Y）Fig.5STR typing with the extraction method of tiangen kit(tg-8-L-Y)方法之一，其提取FFPET价格低廉、经济实用、操作简便，在同一个EP管中进行，减少了污染风险，但其提取的DNA杂质较多，因此适用于大批量检材进行DNA粗略提取16，19。商品化的试剂盒提取法FFPET主要是通过应用特殊的裂解条件释放FFPET中的DNA，在高盐状态下选择性吸附于离心柱内的硅基质膜，经过一系列快速的漂洗和离心，将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，再用低盐的缓冲液将DNA从硅基质膜上洗脱20-22。2款商品化试剂盒各有优点、各有不足：在涉及FFPET检材样本量有限的情况下进行DNA提取时，FP试剂盒法的DNA检出质量以及STR分型更为理想，便于进行后续的鉴定与分析；在进行快速DNA提取时，天根试剂盒耗时最短，且DNA提取质量较好，可应用于需要快速DNA提取的案件之中。参考文献（References）：1 GOELZ S E,HAMILTON S R,VOGELSTEIN B.Purification of DNA from formaldeyde fixed and paraffin-embedded tissuesJ.Biochemical and Biophysical Research Communications,1985,130(1):118-126.449第 5 期2 SATO Y,SUGIE R,TSUCHYA B,et al.Comparison of the DNA extraction methods for polymerase chain reation amplification from formalin-fixed and paraffin-embedded tissuesJ.Diagnos-tic Molecular Pathology,2001,10(4):256-271.3 LEGRAND B,MAZANCOURT P,DURIGON M,et al.DNA genotyping of unbuffered formalin fixed paraffin embedded tis-suesJ.Forensic Science International:Genetics,2001,125(2):205-211.4 柳燕,李莉,赵珍敏,等.甲醛固定石蜡包埋组织STR分型检测 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