甲型和乙型流感病毒感染A549细胞后固有免疫分子的比较研究.pdf

王宏杰等 甲型和乙型流感病毒感染A549细胞后固有免疫分子的比较研究 第 8 期甲型和乙型流感病毒感染A549细胞后固有免疫分子的比较研究王宏杰 解子锋 付福贺 康一晗 田晶 张旭 白梅 牛姝力（锦州医科大学，锦州 121000）中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2023）08-1569-04摘要 目的：探讨固有免疫应答在人肺腺癌细胞A549感染流感病毒进程中的作用。方法：采用100TCID50 A/Brisbane/02/2018（A/BR18，H1N1）和B/Phuket/3073/2013（B/PH13，B Yamagata）流感病毒感染A549细胞，Hoechst染色和流式细胞术检测细胞凋亡，qPCR检测感染后24 h、48 h、72 h细胞因子 IFN-、IFN-、TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及TLR7、Mx1 mRNA水平。结果：与PBS组比较，H1N1组和BY组A549细胞出现不同比例细胞凋亡（P0.01）；H1N1组和BY组IFN-mRNA水平在感染 24 h、48 h、72 h时均升高（P0.01），IFN-mRNA 水平在 48 h和 72 h时显著升高（P0.01）；H1N1组和 BY 组 TNF-、IL-1、IL-6、IL-8和IL-15 mRNA水平在感染48 h、72 h时明显升高（P0.01），IL-10 mRNA水平随感染时间延长呈降低趋势，IL-13 mRNA水平在感染72 h时H1N1组高于BY组（P0.05）；H1N1组和BY组TLR7和Mx1 mRNA水平在感染各时间点均有不同程度升高（P0.05）。结论：固有免疫分子TLR7、促炎细胞因子及炎症抑制因子参与A549细胞抗病毒感染进程，甲型H1N1毒力、致病性和病毒活跃度均高于乙型B Yamagata。关键词 流感病毒；H1N1；B Yamagata；促炎细胞因子；炎症抑制因子Comparative study on innate immune molecules of A549 cells infected with influenza A and B virusesWANG Hongjie，XIE Zifeng，FU Fuhe，KANG Yihan，TIAN Jing，ZHANG Xu，BAI Mei，NIU Shuli.Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China Abstract Objective：To explore role of innate immune response in process of human lung adenocarcinoma cells A549 infected with influenza virus.Methods：A549 cells were infected with 100TCID50 A/Brisbane/02/2018（A/BR18，H1N1）and B/Phuket/3073/2013（B/PH13，B Yamagata）influenza virus.Cell apoptosis was detected by Hoechst staining and flow cytometry.Cytokines of IFN-，IFN-，TNF-，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10，and TLR7，Mx1 mRNA levels were detected by qPCR at 24 h，48 h，72 h post infection.Results：Compared with PBS group，A549 cells in H1N1 group and BY group showed a different proportion of apoptosis（P0.01），levels of IFN-mRNA in H1N1 group and BY group were significantly increased at 24 h，48 h and 72 h post infection（P0.01），IFN-mRNA level in H1N1 group and BY group increased significantly at 48 h and 72 h post infection（P0.01）.Cytokines of TNF-，IL-1，IL-6，IL-8 and IL-15 mRNA in H1N1 and BY groups were significantly increased at 48 h and 72 h post infection（P0.01），and IL-10 mRNA showed a decreasing trend with infection time，IL-13 mRNA were higher in H1N1 group than BY group at 72 h post infection（P0.05）.TLR7 and Mx1 mRNA levels in H1N1 and BY groups were increased at each time point of infection（P0.01）.Conclusion：Innate immune molecules TLR7，pro-inflammatory cytokines and inflammation inhibitors are involved in process of anti-viral infection of A549 cells，and virulence，pathogenicity and virus activity of H1N1 are higher than B Yamagata.Key words Influenza virus；H1N1；B Yamagata；Pro-inflammatory cytokine；Inhibitory inflammatory cytokine流感病毒（influenza virus，IV）是一种严重威胁人类公共健康的呼吸系统病毒。据WHO统计，全球每年约有10亿人感染IV，其中300500万例为重症病例，导致2965万人死于流感相关呼吸道疾病，这些病例中以甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）和乙型流感病毒（influenza B virus，IBV）感染比例最高，造成严重的公共卫生威胁和社会经济损失1。论著/基础免疫学 doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.001本文为国家级大学生创新创业训练计划项目（201910160042）；辽宁省博士科研启动基金计划项目（2020-BS-246）；辽宁省教育厅基本科研面上项目（LJKMZ20221239）。锦州市疾病预防控制中心，锦州 121000。作者简介：王 宏 杰，男，主 要 从 事 临 床 流 感 病 毒 治 疗，E-mail：。通信作者及指导教师：田 晶，女，博士，副教授，主要从事流感病毒免疫机制研究，E-mail：。1569中国免疫学杂志2023 年第 39 卷病 毒 感 染 早 期，机 体 血 清 IL-1、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、IFN、TNF-等细胞因子浓度均有不同程度上升2。甲型（H1 和 H3 亚型）和乙型（B Victoria87 和 B Yamagata88）IV 血凝素头部结构域C末端对转座子诱变均有耐受，但IBV血凝素对转座子介导的插入耐受性比IAV血凝素更低，导致抗原进化能力降低的遗传限制，使其致病性总体弱于 IAV3。但在人肺腺癌细胞 A549 感染 IAV、IBV后比较两型病毒致病性强弱的报道较少，本研究通过 100TCID50 A/BR18 和 B/PH13 两型 IV 感染 A549细胞，观察并探讨感染后细胞凋亡情况及不同时间点炎症因子水平变化，为研究 IV 的致病机制提供支持。1 材料与方法 1.1材料1.1.1病毒株甲型 H1N1 IV 为 A/Brisbane/02/2018（A/BR18），乙 型 B Yamagata IV 为 B/Phuket/3073/2013（B/PH13），由锦州市 CDC 馈赠。人肺腺癌细胞A549购于中国科学院上海细胞库。1.1.2主要试剂RNeasy mini kit 购自德国 QIAGEN；One Step SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit 购自日本TaKaRa公司；细胞凋亡-hoechst染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物公司；RPMI1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、牛血清白蛋白、TPCK-胰酶和HEPES 缓冲液购自美国Gibco公司。1.2方法1.2.1红细胞凝集试验（HA）检测病毒滴度在U型板中将病毒液依次进行倍比稀释，50 l/孔加入1%豚鼠血红细胞悬液，混匀，观察凝集现象。以凝集的最高稀释倍数为终点，其倒数即为病毒滴度。1.2.2 流 感 病 毒 TCID50检 测 A549 细 胞 以 2104/个孔接种于96孔板，37、5%CO2培养24 h；以 病 毒 维 持 液 对 病 毒 进 行 连 续 半 对 数 稀 释（1026.5）；已稀释的病毒液加至A549细胞板对应孔，35 培养 1 h；Hanks清洗，200 l/孔加入病毒维持液 35 培养，观察细胞病变。A/BR18 毒株100TCID50/100 l=1 214，B/PH13 毒 株 100TCID50/100 l=1 447。1.2.3细胞分组实验分为PBS组、H1N1组和BY组。H1N1组：100TCID50 A/BR18吸附1 h，Hanks清洗，加入病毒维持液；BY组：100TCID50 B/PH13吸附1 h，Hanks清洗，加入病毒维持液；PBS组：PBS吸附1 h，Hanks清洗，加入病毒维持液。感染48 h时检测细胞凋亡率，感染24 h、48 h、72 h检测细胞因子及TLR7、Mx1 mRNA水平。1.2.4Hoechst染色将细胞爬片置于24孔板，接种A549细胞，37、5CO2培养24 h，Hanks清洗，100TCID50 A/BR18和B/PH13病毒稀释液感染细胞，1 h后Hanks清洗，500 l/孔加入病毒维持液，48 h后吸尽液体，固定10 min，PBS清洗。500 l/孔加入Hoechst 33258染色液染色5 min，取出爬片，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察。1.2.5流式细胞术检测 A549细胞凋亡A549细胞接种于6孔板，分别在感染48 h收集细胞，制备单细胞悬液：胰酶消化细胞后转至 15 ml 离心管，1 500 r/min离心 5 min，弃上清，加入 500 l缓冲液重悬细胞。细胞染色：加入 AnnexinV-FITC 5 l和7-AAD 3 l，混匀，过300目尼龙筛网至BD流式管，避光515 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。1.2.6RT-PCR 检测各指标 mRNA 水平提取细胞总 RNA，引物由 TaKaRa 公司合成，反应体系：SYBR RT-PCR Buffer 10 l、EX TaqHS（5 U/l）0.4 l、PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 l、PCR Forward Primer（10 mol/L）0.4 l、PCR Reverse Primer（10 mol/L）0.4 l、ROX Reference Dye（50）0.4 l、Total RNA 1 l。PCR 反应条件：42 5 min；95 10 s；95 3 s，60 30 s，共 40个循环；95 15 s，60 1 min，95 15 s 绘制熔解曲线。2Ct计算 相对表达。1.3 统 计 学 分 析 采 用 SPSS22.0 和 GraphPad Prism软件进行统计学分析，数据以x s表示。数据间比较采用单因素方差分析和t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1A549 细胞 Hoechst 染色PBS 组细胞核呈暗蓝色，100TCID50IV感染后A549细胞均有不同程度凋亡，细胞核致密浓染或呈碎块状浓染，呈亮蓝。H1N1组凋亡率高于BY组（P0.05，图1）。2.2A549细胞凋亡情况FCM结果显示，A549细胞感染流感病毒后均出现不同比例细胞凋亡，与PBS组比较差异显著（P0.01），且 H1N1组凋亡比例高于BY组（P0.05，图2）。2.3TLR7 和 Mx1 mRNA 水平与 PBS 组比较，H1N1 组和 BY 组 A549 细胞 TLR7 mRNA 水平在感染 24 h、48 h、72 h 时均显著升高（P0.01），感染 1570王宏杰等 甲型和乙型流感病毒感染A549细胞后固有免疫分子的比较研究 第 8 期48 h 时 H1N1 组 TLR7 水平高于 BY 组（P0.05）。H1N1组和BY组Mx1 mRNA水平较PBS组在各感染时间点均显著升高（P0.01），随感染时间延长呈 上升趋势；感染48 h、72 h时H1N1组Mx1水平高于BY组（P0.05，图3）。2.4TNF-和IFN-mRNA水平与PBS组比较，H1N1组和BY组A549细胞TNF-mRNA水平在感染24 h、48 h、72h时均显著升高（P0.01），随感染时间延长呈下降趋势；感染24 h时H1N1组TNF-水平显著高于BY组（P0.01）。H1N1组和BY组IFN-mRNA水平较PBS组在感染48 h和72 h时显著升高（P0.01），随感染时间延长呈上升趋势；感染72 h时H1N1组IFN-水平高于BY组（P0.05，图4）。2.5TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-10和 IL-13 mRNA水平H1N1组和BY组A549细胞促炎细胞因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8和IL-15 mRNA水平较PBS 组上升，感染 48 h、72 h 时升高幅度显著（P0.01）；H1N1组细胞感染72 h时TNF-、IL-6、IL-8和IL-15 mRNA水平高于BY组（P0.05，图5）。H1N1组和BY组A549细胞炎症抑制因子IL-10 mRNA水平随感染时间呈降低趋势，感染 24 h 时明显高于PBS组（P0.01），而抑制因子IL-13水平随感染时间呈升高趋势，感染48 h、72 h时显著高于PBS组（P0.01），且72 h时H1N1组IL-13水平高于BY组（P0.05，图6）。3 讨论 IAV与IBV每年均会引起流行，且经常同时出现，但IAV感染占比较高，相较于IBV抗原进化率更快，具有独特的大流行威胁4-7。IAV具有广泛的宿主范围，并通过抗原漂移引起大流行，IAV除海豹外几乎没有自然动物宿主，变异速度较慢，常引起局部流行8。因此关于IV致病性和毒力的研究多集Note：*.P0.01 vs PBS group；#.P0.05 vs H1N1 group.图5IV感染后A549细胞TNF-、IL-1、IL-6、IL-8和IL-15 mRNA水平Fig.5TNF-，IL-1，IL-6，IL-8 and IL-15 mRNA levels in A549 cells infected with IVNote：*.P0.01 vs PBS group；#.P0.01 vs H1N1 group.图4IV感染后A549细胞IFN-和IFN-mRNA水平Fig.4IFN-and IFN-mRNA levels in A549 cells infected with IVNote：*.P0.01 vs PBS group；#.P0.05 vs H1N1 group.图3IV感染后A549细胞TLR7和Mx1 mRNA水平Fig.3TLR7 and Mx1 mRNA levels in A549 cells infected with IVNote：*.P0.01 vs PBS group；#.P0.05 vs H1N1 group.图2IV感染后A549细胞凋亡Fig.2Apoptosis in A549 cells infected with IV图1IV感染后A549细胞Hoechst染色（200）Fig.1Hoechst staining of A549 cells infected with IV （200）Note：*.P0.01 vs PBS group；#.P0.05 vs H1N1 group.图6IV感染后A549细胞IL-10和IL-13 mRNA水平Fig.6IL-10 and IL-13 mRNA levels in A549 cells infected with IV1571中国免疫学杂志2023 年第 39 卷中于单一病毒种类感染野鸭、野鸡、小鼠及部分哺乳动物等9-12。国内外IAV、IBV致病性的比较研究较少。本研究采用100TCID50 A/BR18和B/PH13 IV感染 A549细胞，比较 IAV、IBV 引起的细胞形态改变、凋亡及感染后24 h、48 h、72 h细胞因子 IFN-、IFN-、TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10 和 TLR7、Mx1 mRNA水平，探讨两型病毒的致病力差异。本研究表明，A549细胞感染A/BR18和B/PH13后出现明显细胞病变和不同比例细胞凋亡。IFN反应无法控制IV复制，细胞通过程序性死亡激活二次抗病毒反应以达到抗病毒目的13。A549感染相同病毒载量A/BR18所致细胞病变及凋亡水平明显高于B/PH13，提示 A/BR18 致病力和毒力高于 B/PH13。研究表明，细胞通过模式识别受体TLR7识别病毒RNA，通过MyD88信号通路诱导IFN-和一系列炎症因子表达对抗病毒入侵14。Mx1在病毒复制早期通过抑制vRNPs运输至细胞核发挥抗病毒作用15。本研究显示，H1N1组和BY组TLR7、Mx1、IFN-和IFN-mRNA水平较PBS组均显著升高，H1N1组感染 48 h 时 TLR7 水平高于 BY 组，Mx1 于感染 48 h、72 h时高于BY组，IFN-、IFN-水平分别于24 h和72 h高于BY组，提示IAV较IBV具有更强的激活识别受体和抗病毒能力。IV感染后促炎细胞因子过度释放导致“细胞因子风暴”，炎症细胞因子上调幅度受毒株毒力影响16。本研究显示，H1N1组和BY组感染48 h、72 h时细胞炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6、IL-8 和 IL-15 mRNA水平均显著升高。此外，抗炎主调节剂IL-10在免疫应答急性期保护宿主免受组织损伤，IL-13作为多功能细胞因子抑制 NF-B 活性，减少 TNF-、IL-12、巨噬细胞炎症蛋白、趋化因子等表达17。本研究显示IL-10 mRNA水平随感染时间延长呈降低趋势，而H1N1组IL-13水平感染72 h时高于BY组，即 IBV活跃度一般低于 IAV，解释了 IVB很少成为主导株、感染规模较小、感染频率较低等现象。综上，A549细胞感染A/BR18和B/PH13后出现不同程度细胞凋亡及细胞因子表达差异，但A/BR18感染后细胞病变、凋亡率、细胞因子表达等更显著，提示IAV毒力、致病性和病毒活跃度均高于IBV。参考文献：1 KRAMMER F，SMITH G J D，FOUCHIER R A M，et al.InfluenzaJ.Nat Rev Dis Primers，2018，4（1）：3.DOI：10.1038/s41572-018-0002-y.2 CORNISH E F，FILIPOVIC I，SENIUS F，et al.Innate immune responses to acute viral infection during pregnancyJ.Front Immunol，2020，11：572567.DOI：10.3389/fimmu.2020.572567.3 FULTON B O，SUN W，HEATON N S，et al.The influenza B virus hemagglutinin head domain is less tolerant to transposon mutagenesis than that of the influenza A virusJ.J Virol，2018，92（16）：e00754-18.DOI：10.1128/JVI.00754-18.4 VIBOUD C，GOSTIC K，NELSON M I，et al.Beyond clinical trials：Evolutionary and epidemiological considerations for development of a universal influenza vaccine J.PLoS Pathog，2020，16（9）：e1008583.DOI：10.1371/journal.ppat.1008583.5 BEDFORD T，SUCHARD M A，LEMEY P，et 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