甲维盐注干施药对马尾松内生真菌和细菌多样性的影响.pdf
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1、浙 江 林 业 科 技,2023,43(5):6676 J Zhejiang For Sci Technol doi:10.3969/j.issn.1001-3776.2023.05.009 甲维盐注干施药对马尾松内生真菌和细菌多样性的影响 刘鹏1,姜壮2,初楚2,毛赟来2,张绍勇3(1.安吉县人民政府孝源街道办事处,浙江 湖州 313000;2.浙江农林大学 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室,浙江 杭州 311300;3.湖州师范学院 生命科学学院,浙江省媒介生物学与病原传播控制重点实验室,浙江 湖州 313000)摘要:以未施药马尾松 Pinus massoniana 和甲维盐注
2、干施药 5 个月后的马尾松主干内生真菌、细菌为研究对象,采用高通量测序技术 Illumina NovaSeq 6000 对内生细菌(16S rRNA V3+V4)和真菌(ITS)的群落结构和多样性进行分析。结果表明,高通量测序后共得到运算分类单元(operational taxonomic units,OTUs)细菌 1 169 个、真菌 7 250 个,聚类得到细菌 27 门 340 属、真菌 15 门 594 属;与未施药马尾松相比,施药马尾松共有 OTUs 数减少 71.84%;在门、属水平上内生菌群落结构差异不明显,门水平上,相对丰度最高的细菌为蓝藻门 Cyanobacteria和变形
3、菌门 Proteobacteria,真菌为子囊菌门 Ascomycota、担子菌门 Basidiomycota 和被孢霉门 Mortierellomycota,属水平上,相对丰度最高的细菌为蓝细菌目未分类属 unclassified_Cyanobacteriales;Beta 多样性分析表明,组间无明显差异(P0.05);PCoA 分析显示,未施药和施药两组处理细菌群落结构差异不显著,真菌群落结构差异显著;Metastats 分析表明,注干施药松树中色二孢属 Diplodia 的相对丰度显著降低(P0.01)。以上研究结果表明,甲维盐注干施药对马尾松内生真菌和细菌多样性有一定影响,明显降低了色
4、二孢属的相对丰度,有利于马尾松健康,甲维盐注干使用对马尾松安全。关键词:甲维盐;马尾松;内生细菌;内生真菌;高通量测序;多样性分析 中图分类号:S763.1 文献标识码:A 文章编号:1001-3776(2023)05-0066-11 Effect of Trunk Injection of Emamectin Benzoate on Diversity of Endophytic Bacteria and Fungi in Pinus massoniana LIU Peng1,JIANG Zhuang2,CHU Chu2,MAO Yunlai2,ZHANG Shaoyong3(1.Xiaoy
5、uan Subdistrict Administration of Anji,Zhejiang Province,Huzhou 313000,China;2.National Local Joint Engineering Laboratory of High Efficiency Preparation Technology of Biopesticide,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,China;3.College of Life Sciences,Huzhou Normal University,Key Laboratory of Vec
6、tor Biology and Pathogen Transmission Control of Zhejiang,Huzhou 313000,China)Abstract:On April 20th,2022,sample plot with 0.33ha of coniferous and broad-leaved mixed forest was selected,and 20 Pinus massonina trees with 20-35-year age were selected for trunk injection of 2.3%micro-emulsion of emame
7、ctin benzoate.On September 20th,2022,bits of 3 injected trees and 3 controls(non-injection)were sampled from trunk and branch.Community structure and diversity of endophytic bacteria(16S rRNA V3+V4)and fungi(ITS)was carried out by high-throughput sequencing technology Illumina NovaSeq 6 000.A total
8、of 1,169 bacterial and 7 250 fungal operational taxonomic units(OTUs)were obtained,with 27 phyla and 340 genera of bacteria,15 phyla and 594 genera of fungi.The number of OTUs in the injected trees reduced by 71.84%compared with that in the control.The differences in the community structure of endop
9、hytic bacteria at the phylum and genus levels were not obvious.The highest relative abundance of bacteria at phyla was Cyanobacteria and Proteobacteria and that of 收稿日期:2023-03-21;修回日期:2023-07-26 基金项目:浙江省重点研发计划(2019C02024);国家林业局 948 项目(2015-4-40);湖州市公益性研究项目(2021GZ25)作者简介:刘鹏,工程师,从事森林经营与管理;E-mail:。通信作
10、者:张绍勇,副教授,从事生物制药和农林病虫害药剂开发及防治研究;E-mail:。5 期 刘鹏,等:甲维盐注干施药对马尾松内生真菌和细菌多样性的影响 67 fungi was Ascomycota,Basidiomycota,and Mortierellomycota.The highest relative abundance of bacteria at genus level was unclassified_Cyanobac-teriales.The beta-diversity analysis showed there was no significant difference be
11、tween injected trees and control(P 0.05).PCoA analysis showed there were no significant differences in bacterial community structure,but significant differences in fungal community structure between injected trees and contorl.Metastats analysis showed that the relative abundance of Diplodia in injec
12、ted trees was significantly reduced(P 0.01).Key words:emamectin benzoate;Pinus massoniana;endophytic bacteria;endophytic fungi;high-throughput sequencing;diversity analysis 植物体内生菌包括真菌、细菌及放线菌,可定殖于植物器官、组织内部以及细胞间隙中1-2。内生菌与宿主植物协同进化、互利共生,宿主植物为内生菌提供营养物质和生存空间,内生菌经代谢途径产生如生长激素、抗生素、蛋白酶等代谢产物,进一步促进宿主植物的生长发育或抑制其
13、他外来生物侵害3-4。内生菌还协助参与植物某些活性成分和次生代谢产物的合成,同时代谢产物还可提高宿主植物对外界恶劣环境的抗逆性和抗病性5。Wu 等6证实了三七 Panax notoginseng 内生菌的丰富度可影响宿主植物的正常发育,Fadaei 等7发现杜鹃 Rhododendron simsii 内生菌增强了宿主植物的耐盐性。植物内生菌群落结构与植物健康存在关联,植物内生菌的筛选和利用将为生物防治提供新的方向,也可作为评估植物健康状态的依据。马尾松 Pinus massoniana 内生菌研究和松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 病相关联。袁文婷8首次在马尾松
14、上分离得到 20 株内生细菌,通过平板对峙试验筛选出了 NSM-05、NSM-17、NSM-17 三株对病原菌有良好拮抗作用的益生细菌;从马尾松上分离筛选出对松材线虫有活性的益生菌还有解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens、短小芽孢杆菌 B.pumilus、蜡样芽孢杆菌 B.cereus、寡养单胞菌 Stenotrophomonas sp.、芽孢杆菌 Bacillus sp.、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 等9-12。松材线虫能取食大多数内生真菌,从而完成其生活史13-14;从健康马尾松树上分离到的内生菌芽孢杆菌,其代谢产物可致使衰弱
15、松树产生与松材线虫病类似的症状15。故而马尾松内生菌的多样性变化将影响松材线虫种群的变化,进而影响病害的发生。甲维盐注干施药是目前防治松树松材线虫病的有效方法,且对松树和生态环境安全。与传统施药方式相比,甲维盐注干防治可减少药剂浪费、降低环境污染,从而提高利用率,不仅防治效果显著且对非靶标生物较为安全16-18。目前,有关甲维盐注干施药后的防治效果、残留检测和传导分布方面的报道较多19-21,但针对树体微环境上,注干施药影响下的马尾松树体内真菌和细菌多样性的研究报道较少。为评价甲维盐树干注射在马尾松林中的生态安全性,OUYANG 等22从宏观上研究了树干注射不同时期土壤节肢动物和飞行昆虫的群落
16、多样性和群落组成,结果表明甲维盐对总土壤节肢动物和飞行昆虫(膜翅目 Hymenoptera 昆虫)多样性指数无显著影响,但对土壤节肢动物的有害动物多样性指数有显著影响,表明甲维盐注干施药对生态环境的影响是积极的。本文基于高通量测序技术对马尾松主干内生真菌的rDNA ITS1基因和内生细菌的16s rRNA基因进行提取并测序,首次对甲维盐注干前后马尾松树的内生真菌和内生细菌多样性、群落组成特征进行研究,以期为马尾松生长健康评价、生态安全评价、真菌和细菌的多样性资源保育以及森林可持续经营管理等方面提供科学参考。1 材料与方法 1.1 样本采集 试验样地于浙江省杭州市临安区(3029 N,11975
17、 E)海拔 89 114 m 的针阔混交林内,面积约为 0.33 hm2,当年无松材线虫病致死的枯死木,相邻山头有松材线虫病发生,马尾松死亡率小于 0.1%。随机选择 20 株健康马尾松,于 2022 年 4 月 20 日打孔注干 2.3%甲维盐微乳剂(浙江钱江生物化学股份有限公司),其余健康马尾松为对照。采样时间为 2022 年 9 月 20 日,随机采集注药处理 3 株,依次编号为 EB1、EB2 和 EB3;对照 3 株,依次编号为 CK1、CK2 和 CK3,采集样品信息如表 1。所采集马尾松样本均为 20 35 年生,胸径为 14 25 cm,树高为 6.0 8.5 m。采集前对包装
18、袋、柴刀等采集工具进行灭菌,采集时先用柴刀劈掉钻孔点树皮,每次钻孔前均用75%酒精对钻孔点和钻头消毒 20 30 s。同一株马尾松随机钻孔三个点,钻孔点距地面分别为 0.5 m、1.0 m、1.5 m,钻孔深度为 10 cm,孔直径为 7 mm,取三个点的木屑混合均匀为一个样本,立即密封冰盒保存,放于80冰箱68 浙 江 林 业 科 技 43卷 保存,待测。用高枝剪取 6 株马尾松样株的枝条,枝长为 20 cm,直径为 4 6 cm,向阳和背阴向各一枝,同时用斧头劈开树皮取主干质量约 20 g 木屑,并做好标记,密封带回。于室内剪碎取同等质量木屑,采用贝尔曼漏斗法进行线虫分离,镜检并统计松材线
19、虫头数。经检测,所有样本中均未检出松材线虫,如表 1。表 1 马尾松各样本采集信息 Tab.1 Sampled P.massoniana in the sample plot 编号 胸径/cm 树高/m 注药量/mL 松材线虫分离情况/头 松枝(向阳)松枝(背阴)主干 CK1 15 7.5 0 0 0 0 CK2 14 7.5 0 0 0 0 CK3 20 6.0 0 0 0 0 EB1 25 8.5 150 0 0 0 EB2 19 8.5 50 0 0 0 EB3 14 7.5 50 0 0 0 1.2 马尾松内生真菌和内生细菌的高通量测序及分析 1.2.1 DNA 提取和 PCR 扩增
20、基因组 DNA 提取:使用 TGuide S96 磁珠法土壤基因组 DNA 提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司,型号:DP812分别提取 6 个样本的总 DNA,具体操作参照使用说明书。DNA 经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增:以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。细菌 16s rDNAV3+V4高变区使用通用扩增引物为338F-5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3和806R-5-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3;真菌 ITS 扩增引物为 ITS1F-5-CTTGGTCA
21、TTTAGAGGAAGTAA-3和 ITS2-5-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3。采用 TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase,PCR 扩增(10 L 反应体系:95 预变性5 min,95 变性 30 s,50 退火 30 s,72 延伸 40 s,25 个循环,最后 72 延伸 7 min;20 L 反应体系:98 预变性 30 s,98 变性 10 s,65 退火 30 s,72 延伸 30 s,10 个循环,最后 72 延伸 5 min),扩增产物经电泳检测、定量及混样、纯化后,利用 Monarch DNA 胶回收试剂盒对目标片段进行
22、回收。1.2.2 上机测序 6 个样本 DNA 委托北京百迈克生物科技有限公司完成测序,测序平台为 Illumina NovaSeq 6 000 高通量测序仪。1.2.3 序列处理与分析 使用 Trimmomatic v0.33 软件和 Cutadapt 1.9.1 软件对原始测序序列 Raw Reads 进行质量过滤得到高质量序列 Clean Reads;使用 QIIME2 2020.623中的 dada224方法聚类或去噪,经双端序列拼接、去除嵌合体序列得到最终序列;在相似性 97%水平上聚类,获得运算分类单位(operational taxonomic units,OTUs),细菌以 S
23、ILVA 为参考数据库,真菌以 UNITE 为参考数据库,使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释,得到特征对应的物种分类信息,统计各样品群落组成,利用 QIIME 软件生成不同分类水平上的物种丰度表,再利用 R 语言等工具对物种丰度分布、Alpha 多样性指数、稀释性曲线、等级丰度曲线、主成分分析、相关性分析。以上分析均在北京百迈克生物科技有限公司 BMKCloud 云平台网站(http:/ 数据处理 应用 Excel 2016 软件整理和汇总常规数据,用 SPSS 20.0 软件处理和统计分析相应数据。2 结果与分析 2.1 高通量测序数据分析 2.1.1 高通量测序深度和 OTUs
24、分析 对 6 个样本的高通量测序共获得细菌 480 050 对测序序列(Reads),经双端 Reads 质控、拼接后共产生 479 354 条 Clean Reads,每个样品至少产生 79 734 条,平均产生 79 892 条。物种聚类结果为 1 界 27 门 52 纲 126 目 206 科 340 属 368 种细菌。共获得真菌 2 798 314 对 Reads,经双端 Reads质控、拼接后共产生 2 784 536 条 Clean Reads,每个样品至少产生 396 521 条,平均产生 464 089 条,物种聚类结果为 1 界 15 门 48 纲 117 目 271 科
25、594 属 941 种。5 期 刘鹏,等:甲维盐注干施药对马尾松内生真菌和细菌多样性的影响 69 聚类共得到 OTUs 细菌 1 169 个、真菌 7 250 个。未注药组(Group 1,记为 G1)为 CK1、CK2 和 CK3,注药组(Group 2,记为 G2)为 EB1、EB2 和 EB3。各样本 OTUs、共有数和组间共有数统计如表 2。其中,细菌 G1、G2 的 OTUs 总数分别为 686 个和 623 个,共有 OTUs 数分别为 26 个和 29 个,共有 OTUs 数占总数的百分比分别为 20.41%和 22.47%,共有数组间变化不明显,两组共有 OTUs 数为 140
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