甲状腺功能亢进性心脏病患者调节性T细胞与细胞因子水平的相关性.pdf

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淄博 255036)摘 要 目的:探讨甲状腺功能亢进性心脏病(HHD)患者中 CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞(Treg)数量、细胞因子水平的变化与 HHD 相关病变指标的相关性。方法:采用免疫组化染色方法和流式细胞技术检测 HHD 患者和正常人甲状腺组织中 CD25 和 Foxp3 分子的阳性表达及分布情况;通过流式细胞技术检测正常对照组和 HHD 患者术前外周血中 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞数量变化;通过电化学发光技术分析 HHD 血清中甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平;分析 Treg 细胞数量变化与甲状腺自身抗体的相关性;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血白细胞介素(IL)-6、IL-2、干扰素-(IFN-)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、IL-4、转化生长因子-(TGF-)及 IL-10 水平,并同时分析它们与Treg 细胞的相关性。结果:在甲状腺组织中,CD25+和 Foxp3+Treg 细胞主要分布于正常甲状腺的甲状腺滤泡附近,在 HHD 甲状腺中主要分布在淋巴滤泡的浸润淋巴细胞上。与正常甲状腺组织比较,HHD 患者甲状腺组织中炎性浸润显著,CD25+细胞的表达频数明显升高(P0.05),Foxp3+细胞的表达频数显降低(P0.05),同时 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞的表达比例也明显减低(P0.05)。HHD 甲状腺中 Treg 的频数与 TGAb、TPOAb 呈负相关(r=-0.497、-0.489,P0.05),并与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关(r=-0.478,P0.01),与外周血中 IL-10、TGF-水平呈正相关(r=0.682、0.517,P0.05),与血中 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-水平呈负相关(r=-0.476、-0.652、-0.523、-0.491,P0.05)。在外周血中,HHD 组患者的外周血中 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞的比例明显低于正常对照组(P0.05)。HHD 组患者外周血中 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-的水平与正常对照组比较,明显升高(P0.05)。IL-4、TGF-及 IL-10 与正常对照组比较,明显降低(P0.05)。HHD 患者组患者外周血中 Treg 频数与 TGAb、TPOAb 呈负相关(r=-0.477、-0.485,P0.05),在 HHD 外周血中 Treg 数量与 IL-10、TGF-水平呈正相关(r=0.714、0.525,P0.01,P0.05),与血中 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-水平呈负相关(r=-0.536、-0.673、-0.512、-0.498,P0.05),HHD 甲状腺组与正常对照组年龄差异无统计学意义(t=0.612,P0.05)。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。1.2 方法:采用免疫组化染色方法和流式细胞技术检测 HHD 患者和正常人甲状腺组织中 CD25 和Foxp3 分子的阳性表达及分布情况。通过流式细胞技术检测正常对照和 HHD 患者术前外周血中 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞数量变化;通过电化学发光技术分析 HHD 血清中甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平;分析 Treg 细胞数量变化与甲状腺自身抗体和甲状腺细胞病理改变的相关性;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血白细胞介素(IL)-6、IL-2、干扰素-(IFN-)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、IL-4、转化生长因子-(TGF-)及IL-10 水平并同时分析它们与 Treg 细胞的相关性。1.3统计学处理:所有数据采用 IBM SPSS Statis-tics26.0 统计学软件进行分析,计量资料以均数标准差(xs)表示,采用 t 检验;计数资料行2检验。多个样本均数比较进行单因素方差分析,进一步多重比较采用 SNK-q 检验。P0.05 为差异有统计学意义。CD4+CD25+Foxp3+细胞数量变化和甲状腺细胞病理改变的相关性用非参数 Spearman 等级相关分析;外周血 IL-6、IL-2、IFN-、TNF-、IL-4、TGF-、IL-10 水平和甲状腺自身抗体与 CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量的相关性采用直线相关分析。2 结果2.1 HHD 患者甲状腺组织病理变化及血清抗体改变的主要特征:HHD 患者彩超结果显示甲状腺呈现弥漫性肿大,峡部锥体叶肿大,被膜粗厚,内部回声呈网状 CDFI 血流信号丰富,与正常对照组血清TGAb(26.412.1)IU/ml 比较,HHD 组血清 TGAb(325.578.2)IU/ml、TPOAb(140.163.7)IU/ml明显增高。病理学分析可见,HHD 甲状腺呈现弥漫性肿大,峡部锥体叶肿大,腺体质地较韧,组织学分析时可见切面呈分叶状,色灰白灰黄,有时变黑。显微镜下观察发现,甲状腺实质组织广泛破坏,萎缩,较多淋巴细胞浸润,淋巴滤泡形成,纤维组织增生,有时可出现多核巨细胞。甲状腺组织内的炎细胞浸润指数显著提高(表 1)。而正常对照组甲状腺组织的甲状腺滤泡发育成熟,滤泡腔充满胶质,分布均匀,滤泡呈小叶状排列,小叶周围有少量纤维组织和血管,未见炎细胞浸润。表 1 HHD 甲状腺组织内的炎细胞浸润指数(n)组别n1 分2 分3 分4 分总分(分)HHD 组201251268正常对照组 151500015 注:与正常对照组比较,P0.0012.2 HHD 外周血 Treg 细胞的变化及与细胞因子水平、自身抗体、病理改变的相关性:HHD 患者外周血 Treg 细胞的比例(0.810.26)%,明显低于正常对照组的(2.500.69)%,差异有统计学意义(P0.05),而 CD4+CD25+T 细胞的比例明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05)(见图 1、图2)。HHD 患者外周血 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-的水平与正常对照组比较明显升高,差异有统计学意义(P0.05),IL-4、TGF-及 IL-10 与正常对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P0.05)(见表4433吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期3)。Treg 频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关(r=-0.511,P0.05),与 TGAb、TPOAb 呈负相关(r=-0.477、-0.485,P0.05),但与 IL-10、TGF-水平正相关(r=0.714、0.525,P0.05),与 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-水平呈负相关(r=-0.536、-0.673、-0.512、-0.498,P0.05)。2.3 HHD 患者甲状腺组织中 Foxp3+、CD25+、Treg细胞表达水平及与细胞因子水平、自身抗体、病理改变的相关性:Foxp3+细胞在正常甲状腺主要分布于甲状腺滤泡附近,在 HHD 甲状腺主要分布在淋巴滤泡的浸润淋巴细胞上,与正常对照组比较数量显著下降(P0.05)(见表 4、图 3)。CD25+细胞在正常甲状腺主要分布于甲状腺滤泡附近,在 HHD 甲状腺主要分布在淋巴滤泡的浸润淋巴细胞上,在甲状腺细胞密集的区域,CD25 也有不同程度的表达。HHD 甲状腺 CD25 阳性表达明显高于正常甲状腺(P0.05)(见表 4、图 3)。与 CG 组甲状腺 Treg 细胞比例(3.520.78)%比较,HHD 甲状腺 Treg 细胞比例(1.210.79)%明显减低(P0.05),而 CD4+CD25+T 细胞比例明显增高(P0.05)(见图 4、图5)。HHD 甲状腺 Treg 的频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关(r=-0.478,P0.01)。HHD 甲状腺中 Treg 的频数与 TGAb、TPOAb 呈负相关(r=-0.497,-0.4 8 9,P 0.05),与血中 IL-10、TGF-水平呈正相关(r=0.682、0.517,P0.05)。与血中 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-水 平 呈 负 相 关(r=-0.476、-0.652、-0.523、-0.491,P0.05)。图 1 两组外周血 CD4+CD25+Treg 流式检测图 2 两组外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg 流式检测表 3 HHD 患者外周血 IL-6、IL-2、IFN-、TNF-、IL-4、TGF-及 IL-10 测定结果(xs)组别nIL-6(pg/ml)IL-2(ng/ml)IFN-(pg/ml)TNF-(ng/ml)IL-4(pg/ml)TGF-(ng/ml)IL-10(pg/ml)HHD 组2089.6441.4837.8528.972167.94355.4213.558.269.684.491.451.1725.1319.87正常对照组157.524.345.011.521102.56301.427.183.6752.376.5515.944.63133.8112.36 注:与正常对照组比较,P0.01,P0.05表 4 HHD 组甲状腺组织中 CD25 和 Foxp3 的表达(n)组别nCD25(-)(+)(+)PFoxp3(-)(+)(+)PHHD 组1818110.0521350.05)。HHD 患者甲状腺和外周血 Treg 与血中 IL-10、TGF-水平呈正相关,与血中 IL-2、IL-6、IFN-和 TNF-水平呈负相关。推测患者体内降低的 CD4+CD25+Foxp3+Treg 不能抑制体内的自身免疫反应,促进了Th1 类细胞因子分泌,另一反面 Th1 类细胞因子抑制体内效应性 T 细胞过度增值和活化。本研究进一步发现,HHD 甲状腺和外周血 Treg 的频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关。说明 Treg 参与了 HHD 病理进程,与 HHD 发病明显相关。另外还有研究发现 IL-1、IL-6、IL-12、IL-18 等在体外可以明显下调 Treg 细胞的抑制作用13。因此外周血中Treg 细胞对效应性 T 细胞抑制作用失控的原因还需进一步的研究。HHD 患者血清中TPOAb 和TGAb 均有不同程度的升高。甲状腺微粒体抗体是针对甲状腺微粒体的一种抗体,靶抗原为甲状腺过氧化物酶,TPO 是一种与膜结合的血红素蛋白,是甲状腺激素合成的关键酶,也是引起自身免疫性甲状腺疾病的一个重要的自身抗原,其与 TPO 抗体(TPOAb)的免疫反应,会引起自身免疫性甲状腺疾病患者的临床症状的变化。甲状腺球蛋白(Tg)占全部甲状腺蛋白的 75%,是由甲状腺滤泡细胞合成的一种糖蛋白,为甲状腺滤泡胶体及细胞内基质的主要成分。TGAb 是自身免疫性甲状腺疾病患者血清中的一种常见自身抗体。本课题研究发现,HHD 患者血清 TGAb、TPOAb 与 CG 组比较明显升高,为进一步证实 TGAb、TPOAb 的水平与Treg 之间的关系,本研究分析了 CD4+CD25+Foxp3+Treg 与 TGAb、TPOAb 之间的相关性,发现 HHD 甲状腺Treg 的频数与TGAb、TPOAb 呈负相关;HHD 外周血 Treg 的频数与 TGAb、TPOAb 呈负相关;这可能与HHD 患者细胞免疫功能低下有关,而 HHD 患者体液免疫功能增强有关,B 细胞活化产生大量的自身抗体,这可能是由于 Treg 细胞数量减少,不能正常抑制B 细胞的功能。综上所述,HHD 患者甲状腺 Treg 细胞的数量下降,活化的自身反应性 T 细胞大量增加,并因此造成甲状腺内免疫调节失控。HHD 患者甲状腺和外周血 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞明显减少,并且与细胞因子、甲状腺自身抗体及甲状腺病理相关,这群调节性 T 细胞可能通过细胞因子和甲状腺自身抗体参与了 HHD 的病理进程。4 参考文献1 谢卓贝,代 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