间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响.pdf
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1、钟军等 间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响 基金项目:贵州省烤烟公司毕节市公司项目(2022520500240196)作者简介:钟军(1973),教授,博士,主要从事烤烟遗传育种研究,Email: 通讯作者:何轶(1983),研究员,博士,主要从事烟草生产研究,Tel:13397609408,Email: 收稿日期:2022-11-02;网络出版日期:2023-03-31 77 钟军,周慕邱,戴彬,等.间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响J.中国烟草学报,2023,29(5).ZHONG Jun,ZHOU Muqiu,DAI Bin,et al.Effect of
2、 intercropping on the composition and function of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco plantsJ.Acta Tabacaria Sinica,2023,29(5).doi:10.16472/j.chinatobacco.2022.187 间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响 钟军1,周慕邱1,戴彬2,吴文成1,何轶2*1 湖南农业大学农学院,湖南长沙 410128;2 贵州省烤烟公司毕节市公司,贵州毕节 551700 摘 要:【目的】探究利
3、用烤烟与小葱、苦苣和油麦菜三种植物间作缓解其连作障碍,为消除烟田土壤连作障碍提供参考。【方法】采用 16S RNA 高通量测序技术对间作烤烟烟株根际土壤(连作烤烟烟株根际土壤为对照)细菌群落结构组成进行测定分析;利用Tax4Fun 功能预测获得相应样品细菌群落的生态功能。【结果】间作处理的烟株根际土壤细菌群落的 OTU 数、丰度和多样性均大于对照,与 CK 处理相比,小葱(T1 处理)、苦苣(T2 处理)和油麦菜(T3 处理)间作处理的丰度分别增加了 16.52%、12.10%、6.28%,而 OTU 总数分别增加了 6.00%、0.65%、3.49%;在门水平上的 6 个优势菌群中,与 CK
4、 的丰度相比,T1、T2、T3 处理在变形菌门上分别提高了 42.86%、17.85%和 21.43%,厚壁菌门上分别提高了 27.27%、0%和 9.09%,酸杆菌门上分别提高了 9.09%、27.27%和 36.36%,放线菌门上 T2 处理提高了 7.14%而 T1 和 T3 处理分别下降了 28.57%和 14.30%,拟杆菌门上 T1 处理提高了8.33%而 T2 和 T3 处理分别下降了 16.67%和 8.33%,芽单胞菌门上 T1 和 T3 处理分别下降了 50%和 16.67%;在有显著差异的 5个二级功能层上,与 CK 的丰度相比,T1、T2、T3 处理在细胞膜运输功能上分
5、别提高了 96.54%、88.96%和 92.68%,在复制与修复功能上分别提高了 26.93%、25.04%和 23.81%,在翻译功能上分别提高了 24.99%、27.76%和 26.64%,在碳水化合物代谢功能上分别提高了 13.79%、23.75%和 20.12%,在氨基酸代谢功能上分别提高了 28.85、32.21%和 34.21%。【结论】间作显著提高了烟株根际细菌群落的丰富度和多样性、改变了土壤微生物种群结构、提升了整体代谢能力和遗传信息处理能力。关键词:烤烟;间作;根际土壤;细菌群落;结构;功能 土壤微生物作为农业生态系统中重要的组成部分,可产生各种有机酸、激素、抗生素和维生素
6、等多种产物,对维持生态系统平衡起重要作用1-3;土壤微生物的种类、数目及群落结构不仅直接影响养分的转化与组成,也是维持和恢复土壤生产力的主要因素之一。土壤细菌是生态系统中微生物区系的主要组成成分,微生物区系的演变(数量和组成结构)是反映土壤环境质量变化的重要生物指标4-5。有研究表明,利用植物与微生物互作可以提高资源利用、减少农药和化肥的投入,是农业绿色发展的重要内容之一6;而在间作、套作和轮作模式中植物可通过直接或间接作用来改善土壤环境,促进植物充分利用水分和养分、抑制杂草滋生和控制病虫害等7。研究表明,烤烟根际微生态环境失衡特别是土壤细菌群落结构的变化是引起其连作障碍的主要生物因 素8-9
7、;在烤烟连作种植模式中,相同的烟株根系分泌物可能会导致土壤微生物群落结构变得更简单,从而影响土壤理化和生物活性,最终造成烟田土壤质量下降、烟株生长发育受阻、烟叶产量和品质降低、烟株病原体数量增加和土传性病害加重10-14;而采取间套轮作种植模式有利于构建良好的烟田土壤微生态系统,能在一定程度上调控土壤有益微生物种群结构,从而减轻烤烟的连作障碍15-16;葱属作物中挥发物以及浸提液中抑菌活性成分复杂17,常用来与其他植物进行间作18或轮作19以有效缓解连作障碍;苦苣植物根系分泌的黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性20;中国烟草学报 Acta Tabacaria Sinica 2023 Vol.29
8、 No.5 78 植物对土传病害的抗性与根际土壤微生物关系密切,油麦菜的水提液抑制香蕉土壤中病菌数量的效果强于拮抗菌,且改善了香蕉土壤微生物的生态平衡21。而高通测序技术的发展,可同时对多种微生物基因组进行测序,相较于传统的分离培养方法有助于更好地深入研究微生物与作物生长发育之间的关系,为克服连作障碍提供数据支撑22-23。以往对克服烤烟连作障碍的研究主要集中在套作和轮作种植24-25,对间作种植的研究也主要集中在防治病害上,但对间作条件下的烤烟根际土壤微生物环境的研究较少。为此,本研究以贵州毕节威宁县连作烟田为对照,研究小葱、苦苣、油麦菜与烤烟间作烟田对烟株根际土壤细菌群落组成及功能的影响,
9、以期为连作障碍的生态调控提供参考。1 材料与方法 1.1 试验地点和材料 试验于 2022 年 410 月在贵州省毕节市威宁县(10380E,2720N)进行,该地属亚热带湿润季风性气候,平均海拔 2200 m,年平均降雨量在 909 mm左右,年日照时数 1812 h,无霜期 180左右。试验地为连作烟田,每年两季,烤烟种植之后栽种紫花苕,第二年再种植烤烟,土壤为粘性土,pH 5.8、有机质含量 27.77 gkg-1、全氮含量 2.28 gkg-1、速效磷含量 20.63 mgkg-1、速效钾含量 215.66 mgkg-1。供试烤烟品种云烟 87 为当地主栽品种,种植密度为 16500
10、株/hm2。1.2 试验设计和取样方法 以烟田间作小葱(T1)、苦苣(T2)、油麦菜(T3)为处理,不间作的烟田(CK)为对照,共 4 个处理,小区面积 66.7 m2;2022 年 4 月 27 日进行烟株移栽,5 月 10 日分别将间作植物种植于烤烟的两侧(其中小葱、苦苣和油麦菜播种量分别为 82500 株/hm2、33000株/hm2和 16500 株/hm2,行距同烟株的行距 1.2 m,株距为距烟株 20 cm),于 6 月 30 日采集烟株根际土壤样品,重复 3 次。根际土壤取样方法:铲去烟株周围表层 3 cm 深的土壤,用铁铲在距烟株茎秆约 25 cm 处进行深挖,烟株根际露出后
11、,采用抖土法将根系抖落的土混合挑去烟株细根后作为根际土壤样品,重复 3 次,自封袋单独收集土壤样本并暂存于装有冰袋的聚乙烯箱中,再通过 2 mm的土壤筛完全均化,最后储存在-80冰箱、备用。1.3 土壤总 DNA 提取与测序 土壤总 DNA 提取和高通量测序等由北京诺禾生物科技有限公司完成测定。1.4 数据分析 根际土壤细菌种群相对丰度等用 SPSS 16.0 软件进行 One-Way-ANOVA 单因素方差分析,利用QIIME 软件计算 Alpha 多样性指数,利用 R 语言工具制作稀释曲线和土壤细菌群落的组成,通过最大似然法构建系统发生进化树以了解根际土壤细菌的进化关系,利用 Circos
12、 软件制作 Circos 图分析土壤优势物种组成比例及其在样本中的分布比例,利用 LEfSe 软件分析土壤产生显著性差异影响的群落,利用 R 语言中PCoA 分析土壤的菌群结构差异,利用 Tax4Fun 方法将现有的 16S rRNA 基因测序数据与 SILVA 数据库对比以比较功能基因在生物代谢通路上的丰度差异,采用 SPSS 16.0 统计软件对试验数据进行处理,采用独立样本 t 检验分析在 P0.05 水平上的样本间显著性差异18。2 结果与分析 2.1 根际土壤细菌特征分析 2.1.1 丰度和多样性 由图 1 可知,烟田烟株根际土壤细菌丰度的变化随 间 作 植 物 的 不 同 存 在
13、差 异,其 大 小 排 列 为T1T3T2CK,且 T1(间作小葱)处理显著高于 T2(间作苦苣)和 T3(间作油麦菜)处理,与 CK 相比,T1、T2 和 T3 处理烟株根际土壤细菌的丰度分别增加了 16.52%、12.10%和 6.28%。说明烟株根际土壤细菌丰度,间作处理的均显著高于连作烟田(CK);此外,T1 处理烟株根际土壤细菌的丰度比 T2 和 T3 处理的分别增加了 3.95%和 9.64%,说明在烤烟不同的间作植物中,以间作小葱的细菌丰度最高。基于门分类水平对各个处理土壤细菌群落的Alpha 多样性结果表明(图 1),与连作烟田根际土壤细菌(CK)相比,3 种间作处理的 Sha
14、nnon、Ace、Chao 多样性指数均高于对照,其中,T1、T2 和 T3处理在 Shannon 和 Chao 指数上的差异不显著,而 T1处理(3860)与 T2(3757)处理在 Ace 指数上的差异达显著水平但两者与 T3 处理(3812)间的差异均不显著。由此可见,间作处理的烟株根际土壤细菌群落的多样性和均匀度均高于对照。钟军等 间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响 79 图 1 烤烟连作和间作条件下烟株根际土壤细菌丰度和多样性 Fig.1 Bacterial abundance and diversity in rhizosphere soil of flue-cur
15、ed tobacco under continuous and intercropping conditions 2.1.2 OTUs 的维恩图 稀释性曲线显示(图 2A),当细菌测序量达到10000 时,曲线逐渐趋于平缓,结合基于门分类水平的各样本文库的覆盖度均在 98.8%以上,说明基于本试验的测序深度,土壤中包括的稀有物种在内的所有细菌均分布均匀且已得到分析,比较真实地反映了细菌群落组成。OTU 分析表明(图 2B),CK、T1、T2、T3 四个处理分别含有细菌 OTUs 为 4463 个、4731 个、4492个、4619 个;4 个处理共有细菌 OTUs 为 2383 个,分别占各自
16、 OTUs 的 53.40%、50.37%、53.05%、51.59%;4 个处理各自特有的细菌 OTU 分别为 498 个、852 个、508个和644个,分别占各自OTUs的11.16%、18.01%、11.31%、13.42%。这些数据表明,各个处理 OTU 组成存在差异,间作根际土壤不仅 OTU 数目多,还存在更多特有的 OTU。图 2 烤烟连作和间作条件下根际土壤 OTUs 的维恩图 Fig.2 Venn diagram of bacterial OTUs in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under continuous and i
17、ntercropping conditions 2.2 土壤细菌群落组成 2.2.1 细菌群落结构组成 由图 3A 可知,从门水平到种水平,与烟株间作的不同植物类型对根际土壤细菌群落结构有不同的影响。此外,各个处理根际土壤之间细菌进化关系的结果显示(图 3B):进化关系比较近的细菌群落主要有变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacte-riota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、芽单胞菌纲门(Gemmatimonadetes)、绿湾菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteriota)、疣微菌门(Verrucomicr-obiota)、
18、厚 壁 菌 门(Firmicutes)、未 明 确 细 菌(unidentified_Bacteroidota)、硝化螺旋菌门(Nitrospi-rota)、泉 古 菌 门(Crenarchaeota)、蛭 弧 菌 门(Bdellovibrionota)、蓝细菌门(Cyanobacteriota)、粘菌门(Myxococcota)、装甲菌门(Armatimonadota)等 15 个门。中国烟草学报 Acta Tabacaria Sinica 2023 Vol.29 No.5 80 图 3 烤烟连作和间作条件下根际土壤细菌群落结构组成差异 Fig.3 Difference of bacteri
19、al community composition in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under continuous and intercropping conditions 虽然在门水平上相对丰度3%的细菌均相同,分别是变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门,为根际土壤的主要细菌类群,高于其他优势菌群,约占总菌群的 86.73%(图 4A);但 Circos 图却反映出优势菌在不同处理中的分布比例和各个处理优势菌的组成均有所差异(图 4B)。图 4 烤烟连作和间作条件下根际土壤细菌的群落组成 Fig.4 Bacteria
20、l community composition in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under continuous and intercropping conditions 2.2.2 优势菌种组成及其在样本中的分布比例 图 5 从里圈到外圈依次展示各个处理土壤根际优势菌的门、纲、目、科、属水平的物种组成,变形菌门包括 Alphaproteobacteria 纲和 Gammaproteobacteria纲、Sphingomonadales 目和 Xanthomonadales 目、Sphi-ngomonadaceae 科和 Rhodanobac
21、teraceae 科、Sphingo-monas属和Chujaibacter属,芽单胞菌门包括Gemmati-monadetes 纲、Gemmatimonadales 目、Gemmatimonad-aceae 科、Gemmatimonas 属,酸杆菌门包括 Acidobact-eriae 纲、Bryobacterale 目和 Solibacterales 目、Bryobac-teraceae 科和 Solibacteraceae 科、Bryobacte 属和Candidatus_Solibacter 属,拟杆菌门包括 Bacteroidia纲、Chitinophagales目、Chitinop
22、hagaceae科、Flavisolibacter 属,放线菌门包括 Thermoleophilia 纲、Gaiellales 目、Gaiellaceae 科、Gaiella 属,厚壁菌门包括 Bacilli 纲、Bacillales 目、Bacillaceae 科、Bacillus 属。钟军等 间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响 81 图 5 烤烟连作和间作条件下根际土壤优势细菌在样本中的分布比例 Fig.5 Distribution ratio of dominant bacteria in rhizosphere soil of flue-cured tobacco un
23、der continuous and intercropping conditions 基于门分类水平下,最大的是变形菌门,在各个处理中,比例是 T1(40%)T3(34%)T2(33%)CK(28%);第二大类群是厚壁菌门,在各个处理中,比例是 T1(14%)T3(12%)T2=CK(11%);第三大类群是酸杆菌门,在各个处理中,比例是 T3(15%)T2(14%)T1(12%)CK(11%);第四大类群是放线菌门,在各个处理中,比例是 T2(15%)CK(14%)T3(12%)T1(10%);第五大类群是拟杆菌门,在各个处理中,比例是 T1(13%)CK(12%)T3(11%)T2(10%
24、);第六大类群是芽单胞菌门,在各个处理中,比例是 T2=CK(6%)T3(5%)T1(3%);在各个处理的其它菌中,比例是 CK(18%)T2=T3(11%)T1(8%)。与间作处理相比,对照(CK)在变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门所占比例最小,而在放线菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门所占比例稍有提高,但和间作处理的差异不显著。在这 6 个优势菌群中,与 CK 的丰度相比,T1、T2、T3 处理在变形菌门上分别提高了 42.86%、17.85%和 21.43%,厚壁菌门上分别提高了 27.27%、0%和9.09%,酸杆菌门上分别提高了 9.09%、27.27%和36.36%,放线菌门上 T2 处理提高
25、了 7.14%而 T1 和 T3处理分别下降了 28.57%和 14.30%,拟杆菌门上 T1 处理提高了8.33%而T2和T3处理分别下降了16.67%和8.33%,芽单胞菌门上 T1 和 T3 处理分别下降了 50%和 16.67%。2.2.3 细菌群落结构组成的差异性 PCoA 分析(图 6A)中不同颜色的点表示来源于不同的样本,两样本点越接近,表明两样本物种组成越相似。重叠的部分说明土壤细菌群落结构组成有一定的相似性,但 PC1 轴(49.72%)与 PC2 轴(21.08%)的累计贡献量达到 70.80%;其中 CK 处理和 T1、T2、T3 处理在 PC2 轴的方向上分离开来,说明
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