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间充质干细胞-透明质酸水凝胶促进脑缺血小鼠的神经修复.pdf
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1、神经解剖学杂志2023,39(5):556 562Chinese Journal of Neuroanatomy间充质干细胞-透明质酸水凝胶促进脑缺血小鼠的神经修复马琳12,杨观旭”,袁博”,马文倩”,李尚宗”,兰泽鹏,杜雅琳”,文玉军1.2*(宁夏医科大学:1基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,2 颅脑疾病重点实验室,3.临床医学院,银川7 50 0 0 4)【摘要】目的:探讨携带骨髓源间充质干细胞(MSCs)的透明质酸(HA)水凝胶对小鼠脑缺血损伤的修复作用。方法:制备HA水凝胶,培养骨髓源MSCs,将MSCs接种于HA水凝胶上共培养,形成HA-MSCs复合水凝胶;制备小鼠大脑中动脉栓塞(M
2、CAO)模型,2 周后分别将HA水凝胶、HA-MSCs复合水凝胶植入小鼠脑缺血损伤区,观察MCAO组、HA组、HA-MSCs组小鼠运动功能恢复情况;材料植人8 周后将小鼠灌注取脑,观察材料与脑组织整合情况,尼氏染色观察细胞向材料植入区迁移情况,电镜下观察材料植入区神经再生情况。结果:HA水凝胶电镜下呈蜂窝状结构,MSCs形态多样,可在HA水凝胶上粘附生长、增殖;HA-MSCs复合水凝胶植人小鼠脑缺血损伤区4周后可见小鼠前肢运动功能明显恢复(P0.05);材料植入8 周后取材发现植人的材料与脑组织整合良好,尼氏染色显示植人的材料部分降解,有大量细胞向材料植人区迁移、浸润,电镜下可见HA-MSCs
3、植入区有细胞形成连接,有新生的血管和丰富的神经纤维存在。结论:携带MSCs的HA水凝胶可促进小鼠脑缺血后组织修复和运动功能恢复。【关键词脑缺血;透明质酸水凝胶;间充质干细胞;小鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.05.009Mesenchymal stem cells-hyaluronic acid hydrogel promotesneural restoration in mouse with cerebral ischemiaMA Lin-2,YANG Cuanxu,YUAN Bo,MA Wenqian,LI Shangzong,LAN Zepeng,DU Y
4、alin,WEN Yujun.2.(1.Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,School of Basic Medicine,2.Key Laboratory of CraniocerebralDiseases,3.School of Clinical Medicine,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)Abstract Objective:To investigate the effects of hyaluronic acid(HA)hydrogel car
5、rying bone marrow-derivedmesenchymal stem cells(MSCs)on cerebral ischemia in mouse.Methods:HA hydrogel was prepared,bone marrow-derived MSCs were cultured,and MSCs were co-cultured with HA hydrogel to form HA-MSCs composite hydrogel.Themiddle cerebral artery occlusion(MCAO)mouse model was prepared,a
6、nd after 2 weeks,HA hydrogel or HA-MSCscomposite hydrogel were implanted into the cerebral ischemic injury area of mice,respectively.The recovery of locomo-tion of mouse in MCAO group,HA group and HA-MSCs group was evaluated by cylinder experiment.Eight weeks aftermaterial implantation,animals were
7、perfused and integration of material with brain was observed.The migration of cellsto implantation area was observed by Nissl staining,and nerve regeneration in the implantation area was observed bytransmission electron microscope(TEM).Results:HA hydrogel showed a cellular texture,and MSCs had vario
8、us mor-phology,which could grow and proliferate on HA hydrogel.After implanting 4 weeks,the locomotion of the forelimbs ofmice in HA-MSCs group was significantly recovered(P0.05).Eight weeks after implantation,the implanted materi-基金项目:宁夏重点研发计划(2 0 2 1BECG03096);大学生创新创业训练计划(2 0 2 3-11,2 0 2 3-7 0)*通
9、信作者:文玉军电话:138 9 517 7 0 2 7,E-mail:w e n y j n x mu.e d u.c n共同第一作者马琳:间充质干细胞-透明质酸水凝胶促进脑缺血小鼠的神经修复als were well integrated with the brain tissue.Nissl staining showed that the implanted material was partially degraded,and a large number of cells migrated and infiltrated into the implant area.Under TEM
10、,it was found that cells formedconnections,and there were new blood vessels and abundant nerve fibers in the HA-MSCs implanted area,Conclusion:The HA hydrogel carrying MSCs could promote tissue repair and locomotion recovery on cerebral ischemia in mouse.Key words cerebral ischemia;hyaluronic acid(H
11、A)hydrogel;mesenchymal stem cells(MSCs);mouse脑缺血又称为缺血性脑卒中,是一种由脑动脉狭窄或阻塞引起的神经系统疾病,发病率高、致残率高、死亡率高。脑缺血往往导致局部脑组织坏死,形成胶质瘢痕和空洞,造成患者感觉和运动功能障碍,严重影响患者生活质量。间充质干细胞(mesen-chymal stemcells,MSCs)因其易获得、数量多、免疫原性低等优势,成为近年来实验性治疗脑缺血损伤的首选种子细胞,但由于其在缺血损伤区缺乏基质支持、成活率低导致治疗效果不佳2.3。本研究构建一种以透明质酸(hyaluronic acid,HA)为基质,搭载MSCs的HA
12、水凝胶复合支架,植入小鼠脑缺血损伤区,以期能够填补脑组织缺损、支持MSCs生长增殖、促进神经再生、改善小鼠运动功能。材料和方法1.材料1.1实验动物实验动物采用无特定病原体(spe-cific pathogen free,SPF)级雄性C57BL/6J小鼠18只,体重约2 0 g,由宁夏医科大学实验动物中心提供。本项目研究内容和实验操作流程通过宁夏医科大学医学伦理审查委员会的审核批准(宁医大伦理第2 0 2 0-535号)。1.2主要试剂与仪器小鼠麻醉用异氟烷购自深圳瑞沃德公司,透明质酸钠购自山东福瑞达公司,碳二亚胺盐酸盐、已二酸二酰肼、多聚赖氨酸购自美国Sigma公司,DAPI、K i 6
13、7 单克隆抗体、AlexaFluor594羊抗大鼠IgG三抗购自英国Abcam公司,基础培养基DMEM-F12、-MEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司,胎牛血清、pLXSN-GFP、聚凝胺购自北京吉凯公司。2.方法2.1水凝胶制备参照文献报道的方法4 制备HA水凝胶,简要步骤如下:取透明质酸钠0.2 g,加去离子水2 0 ml充分搅拌;加多聚赖氨酸0.0 3g搅拌过夜;加已二酸二酰肼1.5g并滴加1 mol/L的盐酸5ml使其充分混和,调节溶液pH值达3 4;在上述溶557液中加人碳二亚胺盐酸盐0.3g,充分搅拌至形成凝胶;用去离子水清洗凝胶至pH值为7,将其放人冷冻真空干燥仪内冻干。
14、2.2?水凝胶超微结构观察取冷冻干燥的HA水凝胶,用刀片切开制作一个断口,将断口面朝上置于扫描电镜载物台上,真空垂直喷镀10 nm金作为导电镀层,观察水凝胶的超微结构并拍片。2.3骨髓源间充质干细胞培养和标记取3月龄SD大鼠3只,气栓法处死后在无菌条件下取四肢骨和胸骨放人含抗生素的D-Hanks液中漂洗,用-MEM冲出骨髓。将骨髓置于塑料中在37、5%CO,条件下培养,每天半量换液。在DMEM加10%胎牛血清完全培养基中培养逆转录病毒pLX-SN-GFP包装细胞,9 5%10 0%融合时收集pLXSN-GFP上清。在培养的第3代MSCs中加入pLXSN-GFP上清3ml,并加人聚凝胺感染,然后
15、换正常培养基继续培养48 h后再次换液并加入G418(50 100g/ml)筛选7 10 d。在荧光显微镜下观察细胞的转染情况,经筛选后稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的 MSCs 常规传代。2.4间充质干细胞在水凝胶上生长增殖检测将HA水凝胶置于2 4孔板内,调pH值为7,灭菌后加人-MEM和10%胎牛血清浸润,2 4h后接种MSCs,隔天更换培养基。培养5d后进行免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察细胞在材料上的生长、增殖情况,在扫描电镜下观察细胞在材料上的粘附生长情况。2.5细胞免疫组织化学染色将MSCs接种在2 4孔板内或水凝胶材料上
16、,加人-MEM和10%胎牛血清培养5d。用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液固定2 0 min,0.01 mol/L的PBS洗3次;加Ki67抗体(1:10 0 0 稀释),4孵育过夜;用0.0 1mol/L的PBS洗3次后,加入AlexaFluor594羊抗大鼠IgG三抗(1:50 0 稀释),避光孵育2 h;用PBS浸洗后贴片,滴加DAPI染细胞核5min;在激光共聚焦显微镜下观察照相。2.6大脑中动脉栓塞小鼠模型制备采用颧弓人558路电凝法5 制备小鼠右侧大脑中动脉栓塞(middlecerebral artery occlusion,M CA O)模型,简要操作步骤如下:将小鼠固定于手术台上,异
17、氟烷吸人麻醉,用75%酒精、碘伏依次消毒;在右侧外和外耳前连线的中点处作1cm纵切口,依次切开皮肤、皮下筋膜;钝性分离肌,暴露骨,用牙科钻小心钻开直径为3mm的骨窗,充分显露大脑中动脉主干并将其轻轻挑起,用电凝笔凝断血管;充分止血后,用生理盐水冲洗创面,逐层缝合;小鼠术后保温待苏醒。2.7月脑梗死区材料植人及动物分组在小鼠MCAO模型制备2 周后进行材料植人手术。将小鼠固定、麻醉、消毒,在右侧部切开暴露脑组织,吸出坏死液化组织并充分止血,将HA水凝胶植入脑缺血坏死区,此组小鼠为6 只 HA 组;HA-MSCs 组小鼠6 只在植人 HA水凝胶后,在水凝胶内注人 MSCs 细胞悬液10 l(110
18、/l);MCA0组小鼠(6 只)只进行手术操作,不植人材料和细胞。2.8小鼠运动功能检测采用圆筒实验5 分别在材料植人后7、2 8、42、56 d时对小鼠前肢运动功能进行检测。将小鼠放人直径9 cm、高15cm的烧杯内,小鼠将作前肢支撑烧杯壁的站立嗅探活动。观察记录小鼠嗅探2 0 次分别使用左前肢、右前肢、双前肢支撑烧杯壁的次数,计算每只小鼠的前肢不对称使用分值:V(I+C+B)-C/(I+C +B),其中I为脑缺血同侧(ipsilateral)前肢、C为对侧(con-tralateral)前肢、B为双侧(both)前肢。2.9灌注取材、切片、尼氏染色小鼠于材料植入神经解剖学杂志,2 0 2
19、3年9 月第39 卷第5期8周后行左心室-主动脉灌注取材。小鼠深度麻醉后打开胸腹腔,经左心室-主动脉插管,先快速灌人生理盐水30 0 ml,后灌入含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液500ml,取脑后固定4h,于30%蔗糖磷酸缓冲液中脱水后进行冰冻切片,片厚40 m。切片经梯度酒精人水,人尼氏染液染色,梯队酒精上行脱水、透明、封片。2.10电镜取材和超微结构观察材料植人术后8周,每组各取2 只小鼠进行电镜取材和脑缺血区或材料植人区超微结构观察。小鼠深度麻醉后,按照电镜取材要求进行脑组织固定取材、包埋、切片,在透射电镜下观察脑缺血损伤区或材料植入区超微结构。2.11统计学方法小鼠圆筒实验数据以均数标准误表
20、示,采用GraphPad Prism9进行统计分析和做图。3组小鼠的前肢不对称使用分值比较采用双因素方差分析(two-way ANOVA),以P0.05为差异有统计学意义。1.透明质酸水凝胶的大体形态和超微结构制备的HA水凝胶呈透明胶冻状,具有良好的粘弹性(Fig.1A)。扫描电镜下可见HA水凝胶呈蜂窝状结构,疏松多孔,孔洞直径约10 0 m,孔壁薄且上有小孔隙使孔洞相互连通(Fig.1B)。结果Fig.1 Morphology and ultrastructure of HA hydrogel.A:The prepared HA hydrogel showed a transparent j
21、elly shape.B:HA hydro-gel showed a porous honeycomb structure under scanning electron microscope.Bar=100 m in B.2.骨髓源间充质干细胞处于增殖状态培养的大鼠骨髓源 MSCs 形态多样,大多呈梭形、椭圆形,稳定表达GFP(Fig.2 A),表达率为8 7.6%。免疫荧光染色可见,MSCs表达Ki67,表明细胞处于增殖状态(Fig.2)。3.间充质干细胞在透明质酸水凝胶上粘附生长马琳:间充质干细胞-透明质酸水凝胶促进脑缺血小鼠的神经修复将MSCs 接种于HA水凝胶上,培养5 d后进行免疫
22、荧光染色,镜下观察发现MSCs在HA水凝胶上粘附生长、增殖,表达CFP和Ki67(Fi g.3A);扫描电GFP559镜观察可见,MSCs粘附生长于HA水凝胶上,细胞呈圆形,成群存在(Fig.3B)。Ki67BDAPIMergeDFig.2 Bone marrow-derived MSCs prolferated significantly.A:MSCs expressed CFP.B:MSCs expressed Ki67.C:DAPI stainingMSCs nuclei.D:MSCs co-expressed GFP and Ki67.Bar=75 m.GFP/Ki67/DAPIAFi
23、g.3 HA hydrogel supports adhesion and growth of MSCs.A:MSCs grew and proliferated on HA hydrogel and expressed GFP(green)and Ki67(red),nuclei stained by DAPI were shown in blue.B:Under scanning electron microscope,MSCs grew onHA hydrogel.Bar=75 m in A;Bar=50 m in B.4.间充质干细胞-透明质酸水凝胶促进脑缺血小鼠前肢运动功能恢复分别在
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