碱水解法提取女贞子中红景天苷的工艺研究_蒋梅香.pdf

2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2女贞子为木犀科（Oleaceae）女贞属（Ligustrum L.）植物女贞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果实，具有滋补肝肾，明目乌发的功效1。其主要有效成分为三萜类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类及黄酮类等化合物。现代药理研究表明，女贞子提取物具有抗肿瘤、抗骨质疏松症等多种药理作用2。其中红景天苷是女贞子中苯乙醇苷类的代表化合物，同时也是女贞子提取物具有抗肿瘤3、抗氧化4、抗炎5、抗骨质疏松症6-7、降血糖、降血脂8-9、保肝10-11、调节免疫12等药理作用的主要活性成分，但是女贞子中红景天苷的含量一般为0.206%0.434%13。为了提高女贞子中红景天苷的提取率，现已有酶解法14、冰乙酸水解法15、微波提取法16、回流法17-18、冷浸法18、水提醇沉法18等从女贞子中提取红景天苷的方法，但红景天苷的提取率不超过0.91%。笔者基于前期研究19发现，红景天苷可与裂环环烯醚萜通过酯键形成特女贞苷。且文献资料表明，女贞子中还含有十多种含红景天苷结构的裂环环烯醚萜苷20，总含量约为10.76 mg/g21。故本研究采用碱水解法从女贞子中回流提取红景天苷，并用正交试验优化提取工艺，以提高女贞子提取碱水解法提取女贞子中红景天苷的工艺研究*蒋梅香，刘艳，姚淑琼，彭丽英，喻祖文，刘颖新（湖南中医药高等专科学校，湖南株洲412012）摘要目的：优化碱水解法提取女贞子中红景天苷的工艺条件。方法：按照 中华人民共和国药典 中分析方法验证指导原则对含量测定方法进行方法学验证，再通过单因素试验和正交试验对碱水解提取工艺进行优化。结果：最佳碱水解提取工艺参数为提取时间2 h、液固比401（mL/g）、40%乙醇、1.0%NaOH，碱水解后红景天苷提取率达到1.80%，是未经碱水解提取率的8.5倍。结论：该法操作简单、提取率高、环境污染小，为以红景天苷为主成分的女贞子提取物的开发利用提供了理论依据。关键词女贞子；红景天苷；碱水解；提取工艺；正交试验；提取率中图分类号R284.2文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0043-04DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.008Study on the Extraction Technology of Salidroside from Nuzhenzi(LigustriLucidi Fructus)by Alkaline HydrolysisJIANG Meixiang,LIU Yan,YAO Shuqiong,PENG Liying,YU Zuwen,LIU Yingxin(Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou Hunan 412012,China)AbstractObjective:To optimize the extraction technology of salidroside from Nuzhenzi(Ligustri LucidiFructus)by alkaline hydrolysis.Methods:The content determination method was validated in accordance with theguiding principles of the validation of analytical methods in the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China,and the alkaline hydrolysis extraction technology was optimized by single factor test and orthogonal test.Results:The optimum extraction process parameters of salidroside by alkali hydrolysis were extraction time 2 h,liquid-solidratio 401(mL/g),40%ethanol,1.0%NaOH.The extraction rate of salidroside after alkali hydrolysis reached1.80%,which was 8.5 times of that without alkali hydrolysis.Conclusion:This method was simple in operation,high in extraction rate and low in environmental pollution,which provides a theoretical basis for the developmentand utilization of the extract of Nuzhenzi(Ligustri Lucidi Fructus)with salidroside as the main component.KeywordsNuzhenzi(Ligustri Lucidi Fructus);salidroside;alkaline hydrolysis;extraction technology;orthogonal test;extraction rate引用：蒋梅香，刘艳，姚淑琼，彭丽英，喻祖文，刘颖新.碱水解法提取女贞子中红景天苷的工艺研究J.中医药导报,2023,29(2):43-46,67.*基金项目：湖南省教育厅科学研究项目（19C1441）；湖南省青年骨干教师项目（202140）；湖南中医药高等专科学校药食同源功效研究与健康产品开发科技创新团队（202206）432023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2物中红景天苷的含量，为进一步开发和利用女贞子提取物提供理论依据。1仪器与试剂1.1仪器SHIMADZU LC-20AT型高效液相色谱仪、SPD-M20A型检测器（日本岛津公司）；CPA225D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（金坛区水北盛威实验仪器厂）；Milli-Q 型超纯水系统（Millpore公司）。1.2药物与试剂女贞子药材（酒女贞子）（批号：21073112）购自湖南衡岳中药饮片有限公司；红景天苷对照品（批号：110818-202009，纯度：98.6%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，批号：20115121）购自美国天地公司；无水乙醇（分析纯，批号：20211008）购自湖南汇虹试剂有限公司；氢氧化钠（批号：210401）购自上海展云化工有限公司；无水碳酸钠（批号：210618）购自天津市大茂化学试剂厂；碳酸氢钠（批号：20201009）购自汕头市光华化学厂；盐酸（分析纯，批号：20210825）购自株洲市星空化玻有限责任公司；pH试纸（批号：20210515）购自上海三爱思试剂有限公司。2方法与结果2.1分析测定方法2.1.1色谱条件色谱柱为Phenomenex Luna C18（250 mm4.6mm，5.0m）；流动相为甲醇-水（2080），流速为1.0 mL/min；柱温为30；检测器为二级管阵列检测器（DAD），检测波长为275 nm，进样量为10 L。2.1.2对照品溶液的制备精密称取98.6%的红景天苷对照品13.46 mg，加甲醇10 mL制成1.327 mg/mL的红景天苷对照品储备液。精密吸取上述红景天苷对照品储备液4.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得0.530 8 mg/mL的红景天苷对照品溶液。2.1.3供试品溶液的制备精密称取女贞子药材粉末0.5 g，置于150 mL的圆底烧瓶中，加含1.0%氢氧化钠的50%乙醇溶液50 mL，称质量，加热回流2 h，冷却后称质量并补足质量。取上清液，用盐酸调pH值至56，用0.45 m的微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液。2.1.4系统适用性试验精密吸取红景天苷对照品溶液、女贞子供试品溶液各10 L，注入高效液相色谱仪进行测定。在“2.1.1”项下色谱条件下，红景天苷色谱峰对称因子在0.951.05之间，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5 000。（见图1）图 1HPLC 图2.1.5线性关系考察依次精密量取红景天苷对照品溶液，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释制成含红景天苷53.08、106.16、212.32、318.48、424.64、530.80 g/mL的6种不同质量浓度的红景天苷对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分析检测，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y）、红景天苷浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得到回归方程为Y=2 722.9X+1 838.5，r=1.000（n=6）。结果表明红景天苷在53.08530.8 g/mL范围内浓度与峰面积具有较好的线性关系。2.1.6精密度试验精密称取女贞子药材粉末1份，约0.5 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液连续进样6次，记录峰面积，计算红景天苷峰面积的RSD%值为1.14%，说明仪器精密度良好。2.1.7稳定性试验精密吸取女贞子供试品溶液，按上述色谱条件在0、1、2、4、6、8、12、24 h分别进样分析，记录峰面积，计算红景天苷峰面积的RSD%值为1.13%，表明供试品溶液在室温条件下放置24 h稳定性良好。2.1.8重复性试验分两组进行重复性试验，两组各精密称取女贞子药材粉末6份。第1组按“2.1.3”项下制备供试品溶液，测得红景天苷的平均提取率为1.72%，RSD%值为1.10%，结果表明碱水解制备供试品溶液时方法的重复性较好。第2组除不加1.0%氢氧化钠外，其他均按“2.1.3”项下制备供试品溶液，测得红景天苷的平均提取率为0.21%，RSD%值为1.74%，结果表明不加氢氧化钠制备供试品溶液时方法的重复性也较好。设计第二组试验的目的是检测出碱水解前的酒女贞子中红景天苷的提取率，酒女贞子中红景天苷平均提取率为0.21%，与李彦灵等13报道相一致，也为后续加样回收率试验做好准备。2.1.9加样回收率试验精密称取女贞子药材粉末6份，每份约0.5 g，分别置于150 mL圆底烧瓶中，分别精密加入红景天苷对照品适量，按“2.1.3”项下不加氢氧化钠制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。红景天苷的加样回收率见表1，结果表明本方法准确性较好，可用于红景天苷的定量检测。表 1红景天苷加样回收率试验结果（n=6）样品 取样量(mg)样品量(mg)加入量(mg)测得量(mg)加样回收率(%)加样平均回收率(%)RSD(%)1504.11.06361.06162.079397.8498.621.662503.51.06241.06162.068197.373503.11.06151.06162.1462101.094503.01.06131.06162.067197.375504.11.06361.06162.077397.756503.81.06301.06162.1307100.292.2单因素试验考察碱水解法影响因素2.2.1单因素试验方法碱水解回流法提取女贞子中的红景天苷，对影响红景天苷提取率的4个因素进行研究，固定其中3个因素的中间水平，变化第4个因素，各个因素水平选择为提取时间：0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h；液固比（mLg）：201、301、401、501、1001；乙醇浓度：10%、30%、50%、70%、90%；NaOH浓442023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2度：0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，根据以上因素水平进行单因素试验，分别考察各个因素水平对红景天苷提取率的影响。2.2.2提取时间对红景天苷提取率的影响改变提取时间，其他条件不变，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算红景天苷提取率。当回流提取时间在3.0 h内时，红景天苷提取率随提取时间的延长而增加，结果与蒲忠慧等22的研究一致；当提取时间超过3.0 h后，红景天苷提取率明显下降。这可能是红景天苷在高温下长时间与碱液接触发生了降解。提取时间为1.0、2.0、3.0 h时红景天苷提取率较高，因此本研究选取这3个水平为后续工艺优化的水平。（见图2）图 2提取时间对红景天苷提取率的影响2.2.3液固比对红景天苷提取率的影响本组试验中，如果按“2.1.3”项下方法称取0.5 g女贞子粉末进行试验，则在液固比（mLg）为201、301、401和501时会因提取液总量较小，易出现较大误差。因此，调整女贞子药材取样量，液固比为201和301时精密称取女贞子药材粉末2.0 g，液固比为401和501时精密称取女贞子药材粉末1.0 g，液固比为1001时精密称取女贞子药材粉末0.5 g，改变液固比，其他条件不变，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算红景天苷提取率。当液固比在401以下时，红景天苷提取率随着液固比的增大而增加；当液固比超过401时，红景天苷提取率开始下降。液固比为301、401、501时红景天苷提取率较高，因此本研究选取这3个水平为后续工艺优化的水平。（见图3）图 3液固比对红景天苷提取率的影响2.2.4乙醇浓度对红景天苷提取率的影响改变乙醇浓度，其他条件不变，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算红景天苷提取率。当乙醇浓度在50%以下时，红景天苷提取率随着乙醇浓度的增大而增加；当乙醇浓度超过70%时，红景天苷提取率出现明显下降。这可能与红景天苷极性较大，极易溶于水，易溶于甲醇，可溶于乙醇有关23。乙醇浓度为30%、50%、70%时红景天苷提取率较高，且乙醇浓度为50%时红景天苷提取率最高。为更准确地考察乙醇浓度对红景天苷提取率的影响，本研究最后选取40%、50%、60%这3个水平为后续工艺优化的水平。（见图4）图 4乙醇浓度对红景天苷提取率的影响2.2.5NaOH浓度对红景天苷提取率的影响改变NaOH浓度，其他条件不变，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算红景天苷提取率。当NaOH浓度在1.0%以下时，红景天苷提取率随着NaOH浓度的增大而增加；当NaOH浓度超过2.0%时，红景天苷提取率出现明显下降。这有可能是碱液浓度过高，导致红景天苷进一步分解为酪醇24。在因素水平设置时，还有一个0.2%NaOH浓度水平，但是在试验过程中发现，即使液固比为1001时，采用0.2%NaOH浓度水平对女贞子药材粉末进行碱水解回流提取2 h后，提取液的pH值都是约为7左右。这说明0.2%NaOH浓度水平太低，易出现碱水解不完全的现象，导致试验结果偏低，所以最终舍弃该水平。NaOH浓度为0.5%、1.0%、2.0%时红景天苷提取率较高，且NaOH浓度为1.0%时红景天苷提取率最高。为更准确地考察NaOH浓度对红景天苷提取率的影响，本研究最后选取0.5%、1.0%、1.5%这3个水平为后续工艺优化的水平。（见图5）图 5NaOH 浓度对红景天苷提取率的影响2.3正交试验优化提取工艺参数2.3.1正交试验因素和水平的设定根据单因素试验结果，选取提取时间（A）、液固比（B）、乙醇浓度（C）和NaOH浓度（D）这4个因素为正交试验设计的自变量，以红景天苷提取率为指标，设计3个水平，正交试验因素及水平的取值见表2。表 2女贞子中红景天苷碱水解提取工艺正交试验因素及水平水平A（h）B（mLg）C（%）D（%）11301400.522401501.033501601.52.3.2正交试验设计方案与结果精密称取女贞子药材粉末2.0 g，置于250 mL的圆底烧瓶中，按照L9（34）正交表安排试验，加含碱性氢氧化钠的乙醇溶液，称质量，加热回流，冷却后称质量并补足质量。取上清液10 mL，用盐酸调pH值至56，精密量取5 mL溶液至25 mL容量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 m的微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液，测定峰面积，计算红景天苷提取率。结果见表3。液固比（mLg）452023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2（下转第67页）表 3女贞子中红景天苷碱水解提取工艺正交试验结果红景天苷提取率（%）Tt111111.6361.6343.270212221.7541.7623.516313331.6731.6783.351421231.6521.6213.273522311.7011.7253.426623121.7571.6943.451731321.7001.7213.421832131.7571.7253.482933211.6361.6633.299K110.1379.96410.2039.995K210.15010.42410.08810.388K310.20210.10110.19810.106R0.0650.460.1150.393注：Tt=+；K1、K2、K3均采用Tt值计算由直观分析可知，影响女贞子中红景天苷的碱水解提取工艺的主次因素排列顺序为BDCA，最佳提取工艺条件为A3B2C1D2。采用SPSS 26.0软件对以上数据进行有重复的正交试验方差分析，得到分析结果见表4。表 4正交试验方差分析结果变异来源 平方和（SS）自由度（df）均方（MS）FPA0.00020.0000.4550.648B0.01920.00921.4740.000C0.00120.0011.6260.249D0.01420.00715.8020.001从表4可知，因素B和D对红景天苷提取率的影响达到了显著性水平，而因素A和C没有达到显著性水平。因此再对因素B和D进行多重比较，结果见表56。表 5因素 B 的 Duncan 法多重比较子集（alpha=0.05）12显著性检测结果B161.660 67bB361.683 50bB261.737 33aP0.0901.000注：显著性检测结果为a时对应的水平为该因素的最佳水平表 6因素 D 的 Duncan 法多重比较子集（alpha=0.05）12显著性检测结果D161.665 83bD361.684 33bD261.731 33aP0.1581.000注：显著性检测结果为a时对应的水平为该因素的最佳水平最终，由正交试验的方差分析结果及因素B和D的Duncan法多重比较可知，因素B的最佳水平为B2，因素D的最佳水平为D2。再结合直观分析结果和节约资源的原则，将最佳提取工艺条件修正为A2B2C1D2，即提取时间2 h、液固比401、40%乙醇、1.0%NaOH。2.3.3正交试验验证试验按修正后的提取工艺参数进行3次平行试验，红景天苷提取率分别为1.80%、1.80%、1.79%，得出红景天苷平均提取率为1.80%。3小结与冰乙酸水解15比较，碱水解酯苷的反应更彻底，红景天苷提取率更高。这是因为一般的苷键属缩醛结构，对稀碱较稳定，不易被碱催化水解25，如：酪醇与葡萄糖就是通过缩醛结构的苷键形成红景天苷。而酯苷、酚苷、烯醇苷及成苷羟基的-位有吸电子基团的苷，易被OH-进攻而水解25，如：红景天苷与裂环环烯醚萜形成的就是酯苷。故只要优选碱水解的提取工艺参数，是可以只水解酯苷而不水解或较少水解缩醛结构的苷键的。因此，选择碱水解法来提取女贞子中的红景天苷。4结论本研究采用正交试验优化碱水解回流提取女贞子中红景天苷的工艺参数。正交试验结果显示，最佳提取工艺参数为提取时间2 h、液固比401、40%乙醇、1.0%NaOH，在此条件下女贞子中红景天苷的提取率达到了1.80%，各因素对红景天苷提取率的影响大小顺序依次为液固比NaOH浓度乙醇浓度提取时间。本研究与其他方法14-18（最高0.91%）相比，较大地提高了女贞子中红景天苷的提取率，且操作简单、对环境污染小、成本低，有利于工业化大生产，可再与分离纯化技术结合，为以红景天苷为主成分的女贞子提取物的开发和利用提供理论依据。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部S.北京：中国医药科技出版社，2020.2 刘美红，邹峥嵘.女贞子化学成分、药理作用及药动学研究进展J.热带亚热带植物学报，2022，30(3)：446-460.3 闫圣玉，谢亚锋，刘英，等.红景天苷抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人结直肠癌细胞凋亡和自噬J.中国免疫学杂志，2021，37(1)：61-65.4 侯红平，张广平，高云航，等.红景天苷对慢性阻塞性肺疾病体外细胞模型的保护作用及抗氧化应激机制J.中药新药与临床药理，2020，31(12)：1389-1393.5 杨泽霖，黄鑫，刘俊杰，等.红景天苷调控PI3K/Akt信号通路对LPS诱导的BV2小胶质细胞的抗炎作用J.中国药理学通报，2019，35(8)：1145-1149.6 ZHANG J K，YANG L，MENG G L，et al.Protectionby salidroside against bone loss via inhibition of oxidativestress and bone-resorbing mediatorsJ.PLoS One，2013，8(2)：e57251.7 LI L，QU Y，JIN X，et al.Protective effect of salidrosideagainst bone loss via hypoxia-inducible factor-1 pathway-induced angiogenesis J.Sci Rep，序号ABCD液固比BNNaOH浓度DN462023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.22016，6：32131.8 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