浮游菌测试操作作业规程.doc

QCA/QC-SOP05-003

山东良福制药有限公司
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浮游菌测试操作规程
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第05版
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1. 主题内容和合用范畴
本规程规定了公司干净室（区）中浮游菌测试条件，测试办法及控制原则。
本规程合用于公司干净室（区）浮游菌测定和干净度级别验证。
2. 有关文献
《药物生产质量管理规范》
《医药工业干净室（区）浮游菌测试办法》 GB/T16293—
3. 术语
3.1 干净室（区）
对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制房间或区域。其建筑构造、装备及其使用，均具备减少对该区域内污染源介入、产生和滞留功能。
3.2 干净工作台
一种工作台或者与之类似一种封闭围挡工作区。其特点是自身可以供应通过过滤空气或气体，如垂直层流干净工作台、水平层流干净工作台、自净器等。
3.3 菌落
细菌培养后，由一种或几种细菌繁殖而形成一细菌集落，简称CFU。通惯用个数表达。
3.4 浮游菌
用本规程提及办法收集到活微生物粒子，通过专用培养基，在适当生长条件下繁殖到可见菌落数。
3.5 浮游菌浓度
单位体积空气中含浮游菌菌落多少，以计数浓度表达，单位是个/m3或个/L 。
3.6 静态测试
干净室（区）净化空气调节系统已处在正常运营状态，工艺设备已安装，干净室（区）内没有生产人员状况下进行测试。
3.7 动态测试
干净室(区)已处在正常生产壮态下进行测试。
4. 职责
中心化验室微生物限度检查室人员负责浮游菌定期检测工作。
5. 质量原则
5.1 环境菌落监测原则
区域
内容
D级干净区
万级干净区
百级干净区
原则cfu/平皿
≤200
平均≤100
平均≤1
警戒限度cfu/平皿
160
2
---------
测定频次
1次/季
1次/日
1次/班
说
明
D级区平皿菌落数平均不得超过200个。
6. 材料与设备
6.1 设备
浮游菌采样器、净化工作台、恒温培养箱、烘箱、高压蒸汽灭菌器、放大镜、显微镜、电冰箱、
菌落计数器。
6.2 用品
培养皿（平皿）：Ø90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿。钢精锅：10000ml。三角瓶：300ml。天平、称样纸、勺。此外还需要棉塞、牛皮纸、线绳、微波炉、玻璃棒、海棉擦、毛刷等用品。
6.3 空白培养皿准备
6.3.1 包扎
取干净、干燥培养皿用牛皮纸或专用包皮布包严扎紧待灭。
6.3.2 灭菌
灭菌采用湿热灭菌法。条件：0.12Mpa、121℃，20min。灭菌时要注意按照操作规程操作高压蒸汽灭菌器。
6.3.3 传播
将灭菌并用余热烘干后平皿，传至准备间，并用紫外线照射备用。空白平皿普通在注皿前24小时内灭菌，传入。
6.3.4 质量规定
已备好待用平皿应保证无损、无污、无菌、干燥。
6.4 培养基准备及灭菌
6.4.1 大豆酪蛋白琼脂培养基制备。
取大豆酪蛋白琼脂培养基约34g，加蒸镏水1000ml加热溶解即得。
6.4.2 溶解与分装
培养基配制好后，分装入干净干燥300ml三角瓶内，约200ml/瓶，并塞好棉塞，扎上牛皮纸帽，待灭。
6.4.3 培养基灭菌
采用湿热灭菌法。除另有规定外，条件0.12MPa，121℃，20分钟。注意：灭菌结束后自然降压，以防培养基在突然降压后沸腾。
6.5 注皿
6.5.1 无菌室应整洁、有序，各用品处在定置状态。
6.5.2 注皿前对无菌室作恰当消毒和清洁，并开紫外线照射30分钟。
6.5.3 把准备好空白平皿去掉牛皮纸，放在工作台上，按每若干个为一组摞齐摆好。
6.5.4 灭菌培养基，加热溶化传入无菌室，用75%酒精擦试瓶体后，放在工作台上，打开紫外线照射，待其冷至45℃左右时，开始注皿。
6.6 注皿操作
6.6.1 操作员消毒手，做房间和工作台环境皿。
6.6.2 操作员在符合100级空气干净度条件层流净化工作台上将培养基注入培养皿。
注入量：Ø90mm培养皿15ml。注皿时，三角瓶倾斜，把皿盖微微打开（不超过45O角），将培养基注入皿中，动作尽量快、稳、轻。
6.6.3 将注好平皿，每若干个为一摞排放整洁，用浸有75%酒精绸布盖上，打开紫外灯照射待凝。
6.6.4 凝固后，平板倒过来，收入筐内，包好，放培养箱中预培养，30～35℃，48小时，看培养基自身与否染菌。
6.6.5 质量规定：制备好培养皿（基），经48小时培养后，无菌生长方可进入待用状态。若长菌培养皿不不大于该所有培养皿10%，视为该批培养基不合格。应倒掉重新配制。
6.7 用品洗涤
6.7.1 用后培养皿清洗
使用后，先用海棉擦沾水和洗衣粉擦去皿盖上记号，然后铲出培养基，用海棉擦或毛刷蘸洗涤剂在温水中洗干净，用自来水冲四、五次，再用蒸镏水冲洗2～3次，烘干，备用。
6.7.2 用后三角瓶和钢精锅清洗。
使用后，先用热水烫洗1～2次，然后用毛刷蘸洗涤剂刷洗干净，用自来水冲四、五次，再用蒸镏水冲洗2～3次，晾干，备用。
7. 测试办法
7.1 测试办法
本测试办法通过带浮游微生物空气高速通过微孔，被均匀撞击在培养皿内琼脂表面；这些活体微生物在琼脂表面获得均匀和充分，在培养过程中，迅速发生动态再水化过程，高速生长，从而更快得出成果。在适当条件下让其繁殖到可见菌落进行计数，以平板培养皿中菌落数来鉴定干净环境内活微生物数，并以此来评估干净室（区）干净度。
7.2 培养皿选用Ø90mm 型
7.3 采样点布置
培养皿应布置在具备代表性且气流扰动极小地方。
采样点位置详细规则见附件一
A.1 干净室（区）采样点布置宜力求均匀，避免采样点在局部区域过于稀疏。下列多点采样采样点布置图示可作参照。（见图A.1）

图A.1 平面采样点布置图
A.2 100级单向流区域，干净工作台或局部空气净化设施采样点宜布置在正对气流方向工作面上，气流形式可参照如下图A.2、图A.3。

图A.2 水平单向流气流形式

图A.3 垂直单向流气流形式
7.4 至少采样点数目参见5.4.1.1采样点普通在工作面上0.2m高度平面上均匀布置。至少采样点数目
浮游菌至少采样点数目可按表一拟定。
表一 至少采样点数目
面积m2
干净度级别
100
10000
100000
300000
<10
2~3
2
2
2
≥10~<20
4
2
2
2
≥20~<40
8
2
2
2
≥40~<100
16
4
2
2
≥100~<200
40
10
3
3
≥200~<400
80
20
6
6
≥400~<1000
160
40
13
13
≥1000~<
400
100
32
32
≥
800
200
63
63
注：对于100级单向流干净室（区），涉及100级干净工作台（bench），面积指是送风口表面积；对于10000级以上非单向流干净室（区），面积指是房间面积。

表二 最小采样量
干净度级别
采样量 L/次
100
1000
10000
500
100000
100
300000
100
注：每个采样点普通采样一次，对于单向流干净室或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流干净室，采样口应向上。
培养皿在用于检测时，为避免培养面在运送过程中导致影响，宜同步进行阴性对照实验，每次或每个区域取一种对照皿，与采样皿同法操作单不需要暴露采样，然后与采样后培养皿一起放入培养箱内培养，成果应无菌落生长。
7.5 采样办法
7.5.1 环境皿
对环境进行静态测试，测试人员必要穿戴符合环境干净度级别工作服，室内测试人员不得多于二人，将已制备好培养皿按规定放置，打开皿盖约2/3，皿盖搭在皿底沿上，不得过大或过小，使培养基表面暴露0.5小时后，将皿盖合上。
7.5.2 人员手皿
在进入干净区前或操作过程中对人员做手皿，操作者手拿制作好培养皿，
左手在下，右手在上，右手拿皿底，左手拿盖始终向上，打开后，被检者伸开手掌，手心向上，手指轻轻触碰培养基，培养基上应有指纹，然后迅速合上盖子。
7.5.3 无菌衣做皿
对灭菌后无菌衣做皿时，取中间某些，右手拿皿底，左手拿皿盖和物品，将物品轻轻和培养基接触，合上盖子。
7.5.4 工艺用水和消毒剂做皿
用管道输送工艺用水和消毒剂做皿时，在取样处，打开龙头，流量不要太大，打开平皿，令皿底侧竖起来，迅速用工艺用水或消毒剂冲刷一下，然后迅速合上盖子。
7.6 培养
7.6.1 培养温度：30～35℃；培养时间：48小时。
7.6.2 每批培养基选定几只培养皿作空白对照培养，以检查培养基自身与否受到污染。
7.7 菌落计数
7.7.1 用肉眼直接计数，必要时用5—10倍放大镜检查有否漏掉，并记录。
7.7.2 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
7.7.3 成果计算
菌落数
平均菌落数M(——)= -——————————
采样量
如发现某处持续染菌，则应用显微镜分析菌型，并进行因素分析。
7.7.4 成果鉴定
以浮游菌判断干净室（或干净区）干净度与否合格，根据按照5.1中原则。
7.7.5 测试报告中应记录房间温度、相对湿度、压差及测试状态。
7.8 注意事项
7.8.1 测试用品要作灭菌解决，以保证测试可靠性，对的性。
7.8.2 采用一切办法防止人为对样本污染。
7.8.3 对培养基，培养条件及其她参数作详细记录。
7.8.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时普通用透射光于培养皿背面或正面仔细观测不要漏计培养皿边沿生长菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物区别，必要时用显微镜鉴别。
7.8.5 采样前应仔细检查每个培养皿质量，如发现变质，破损或污染应剔除。
7.8.6 干净室（区）在静态条件下检测浮游菌数应符合规定。
7.8.7 使用测试仪器时应严格按照仪器阐明书操作。
7.8.8 采样管长度应依照测点高度定，尽量减少弯曲。
7.8.9 采样管禁止渗漏，内壁应光滑。
8. 有关记录
《浮游菌测试记录》
9. 颁发部门
技术质量部
10. 发放范畴
办公室1份，技术质量部2份，共3份。
11. 修改栏
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