多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制_李琳.pdf

现代医学Modern Medical Journal2023，Apr;51(4):432-441 收稿日期2023-01-23 修回日期2023-03-12 基金项目陕西省自然科学基础研究项目(2020JQ-466)作者简介李琳(1986 )，女，陕西咸阳人，主管护师。E-mail:qhjzlilin163 com 通信作者梁晓丽E-mail:532413579 qq com 引文格式李琳，刘善收，虎晓岷，等 多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制 J 现代医学，2023，51(4):432-441 论著 多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制李琳1，刘善收2，虎晓岷2，王仙琦2，代铮2，梁晓丽2(1 西安市秦皇医院 急诊科，陕西 西安710699;2 空军军医大学第一附属医院 急诊科，陕西 西安710032)摘要目的:探索敌草快中毒时肾小管上皮细胞内显著变化的基因和信号通路，为阐明敌草快中毒相关肾损伤的病理机制和优化临床治疗措施提供科学依据。方法:通过灌胃给药构建小鼠敌草快中毒模型，分析染毒后肾脏形态学和功能学的变化，并分选小鼠肾小管上皮细胞进行 mNA 和 microNA 测序。筛选敌草快中毒后显著差异的基因并进行功能富集，分析中毒组肾小管上皮细胞内显著激活的信号通路。结果:(1)敌草快中毒后小鼠血浆中 IL-6、肌酐和尿素氮含量显著升高;肾脏肿胀，暗红质脆;肾小管上皮细胞肿胀，部分空泡变性，偶见坏死;红细胞管型和蛋白管型致管腔狭窄甚至闭塞;肾间质充血伴炎症细胞浸润。(2)中毒后肾脏上皮细胞 1 925 种基因上调，3 858 种基因下调，其中促炎因子(TNF 和 MMP8)、趋化因子(CCL2、CXCL1 和 CXCL2)和促凋亡分子(BAK、Tnfsf14 和 Caspase3)显著增加，抑炎因子(SOCS 和 TGF-)以及抑制凋亡分子(BCL2)显著降低。(3)中毒后 144 种 microNA 上调，146 种 microNA 降低，其中 microNA-21可靶向调控差异基因 MMP-8 和 VCAM-1;microNA-30a 与 BCL2L11 存在靶向关系。(4)GO、KEGG 和GSEA 功能分析提示差异基因在程序性细胞死亡、氧化应激和炎症反应相关信号通路中富集，主要包括凋亡、IL-17、NF-B 和 MAPK 等信号通路。结论:敌草快中毒后肾脏显著损伤，肾小管上皮细胞内促炎因子和促凋亡分子增加，抑炎和抑凋亡分子降低;程序性细胞死亡、氧化应激和炎症反应等信号通路参与敌草快中毒相关肾损伤。未来，可针对本研究中的核心分子开发靶向治疗药物，优化临床策略，改善患者预后。关键词敌草快中毒;多组学测序;肾小管上皮细胞;病理机制;靶向治疗;小鼠 中图分类号363 文献标志码A 文章编号1671-7562(2023)04-0432-10doi:10 3969/j issn 1671-7562 2023 04 002Analysis of the pathological mechanism of renal tubular epithelial cellinjury induced by Diquat based on multigroup sequencingLI Lin1，LIU Shanshou2，HU Xiaomin2，WANG Xianqi2，DAI Zheng2，LIANG Xiaoli2(1 Emergency Department of Qin Huang Hospital，Xian 710699，China;2 Emergency Department of the FirstAffiliated Hospital of PLA Air Force Medical University，Xian 710032，China)Abstract Objective:To explore the genes and signal pathways that significantly change in renal tubularepithelial cells of Diquat-poisoned mice，in order to provide scientific basis for clarifying the pathologicalmechanism of diquat related renal injury and optimizing clinical treatment measures Methods:We established amodel of Diquat-poisoned mice by intragastric administration The changes of renal morphology and function were234analyzed after exposured to Diquat，and the renal tubular epithelial cells of mice were sorted for mNA andmicroNA sequencing After screening and functional enrichment of genes with significant differences after Diquatpoisoning，We analyzed the signal pathways which significantly activated in renal tubular epithelial cells inpoisoning groups esults:(1)The plasma concentrations of IL-6，creatinine and urea nitrogen of Diquat-poisoned mice were significantly increased After exposured to Diquat，the kidney swelled，dark red and fragileThe epithelial cells of renal tubules swelled，some of which showed vacuolar degeneration or necrosis The lumen ofthe renal tubules is blocked by red blood cell and protein tubular types Many inflammatory cells infiltrated therenal interstitium(2)1 925 kinds of genes were up-regulated and 3 858 genes were down-regulated in renalepithelial cells after exposured to Diquat The proinflammatory factors(TNF and MMP8)，chemokines(CCL2，CXCL1 and CXCL2)and pro-apoptotic molecules(BAK，Tnfsf14 and Caspase3)were significantly increasedAnti-inflammatory factors(SOCS and TGF-)and anti-apoptotic molecule(BCL2)were significantly reduced(3)144 kinds of microNAs were up-regulated and 146 microNAs were down-regulated in poisoned renalepithelial cells Significantly increased microNA-21 may target MMP-8 and VCAM-1 There was also a targetingrelationship between microNA-30a and BCL2L11(4)The differentially expressed genes were enriched in signalpathways related to programmed cell death，oxidative stress and inflammatory response，mainly including apoptosis，IL-17，NF-B and MAPK signaling cascade，etc Conclusion:Kidney is damaged significantly after exposured toDiquat In poisoned renal tubular epithelial cells，pro-inflammatory factors and pro-apoptotic molecules increase，while anti-inflammatory and anti-apoptotic genes decreaseThe signal pathways of programmed cell death，oxidative stress and inflammatory response are involved in the Diquat-poisoned related renal injuryThedevelopment of therapeutic measures targeted to the core molecules is expected to optimize the clinical strategy andimprove the prognosis of patients Key wordsDiquat poisoning;multigroup sequencing;renal tubular epithelial cells;pathological mechanisms;targeted therapy;mice国内限制百草枯使用后，敌草快在农业生产中应用逐渐增多1，中毒病例也随之增加2-4。目前尚无特效解毒剂，重症患者因多脏器衰竭死亡，28 d 病死率为 60%5。敌草快中毒常累及胃肠道、肾脏、肝脏、肺和神经系统，严重威胁患者生命健康，治疗措施优化是目前研究的热点，也是急诊医师面临的重大挑战。本课题组既往临床调查4 发现，与百草枯不同，敌草快中毒以急性肝肾功能损伤为主，很少出现难治性肺纤维化;中毒后患者肌酐迅速升高，死亡组更显著，急性肾损伤是预后不良的危险因素。我们既往构建小鼠染毒模型，发现脏器炎症损伤显著，肺纤维化少见且轻微6。肾脏也是敌草快的主要排泄器官，据报道尿敌草快浓度和血肌酐可用来评估病情和预后4。大部分临床中毒病例出现蛋白尿，重症病例甚至 24 h 内发展为急性肾衰竭7-8，组织活检提示急性肾小管坏死9-10，但敌草快中毒相关肾损伤的病理机制尚未完全阐明。大鼠实验提示 IL-17 和核因子-B(NF-B)信号通路参与敌草快肾损伤的发生发展11，氧化应激和脂质过氧化也可能与脏器损伤相关12。本实验通过灌胃给药构建小鼠敌草快中毒模型，分析染毒后肾脏形态学和功能学的变化，并分选肾小管上皮细胞进行测序，初步探讨敌草快中毒肾小管上皮细胞的可能病理损伤机制，为优化临床治疗措施提供科学依据。1材料与方法1 1动物伦理与染毒模型构建本研究中所有与动物相关的实验操作均遵循实验动物管理和使用指南，并经空军军医大学实验动物中心福利与伦理委员会批准(编号:20190305)。实验用 C57BL/6 雄性小鼠购自空军军医大学动物中心，8 10 周龄，(25 30)g，在标准实验室饲养 7 d，一致性处理后构建敌草快染毒模型。敌草快标准品(BW61372)购自北京万物标准科技有限公司，干粉制剂配制成 10 mgml1稀释溶液。将 20 只 C57BL/6 雄性小鼠分为中毒组和对照组，每组 10 只;中毒组按照 100 mgkg1敌草快剂量，约400 l 稀释液灌胃;对照组 400 l 生理盐水灌胃。48 h后摘眼球取外周血离心获得血浆，使用 ELISA 试剂盒(上海江莱生物技术有限公司)检测血浆中炎症因子(IL-6)和肾功能标志分子(肌酐和尿素氮)的含量。334李琳，等 多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制1 2肾脏 HE 染色与病理评分肾组织在 10%甲醛溶液中固定，脱水、浸腊、包埋，制作 5 m 厚度石蜡切片，然后用苏木精和伊红染色，观察形态学变化。病理医师随机观察 5 个视野，从4 个方面进行病理评分，包括肾脏大体形态(肿胀程度、色泽和出血瘀斑)、肾小管病变(红细胞管型、蛋白管型、上皮细胞肿胀及变性坏死)、肾小球病变(肾小球结构、肾皮质与髓质分界)和炎症细胞浸润。按损伤程度赋予分值(0 3 分)，具体标准为 0 分=无损伤，1 分=轻微损伤，2 分=中度损伤，3 分=重度损伤。4 个单项得分总和为该样本病理评分，分数越高表示损伤越严重。1 3免疫荧光(IF)染色肾脏包埋后用冷冻切片机切割 4 0 m 厚度切片，然后用1%BSA 封闭60 min，加入 F4/80 抗体(#ab100790，Abcam 公司)孵育过夜。PBS 洗涤后加入二抗(#sc-362272，Santa Cruz 公司)避光孵育 1 h。在荧光显微镜下观察并拍照，使用 Image J 软件测量随机视野中 F4/80 荧光强度，分析肾脏组织炎症细胞浸润程度。1 4分选肾小管上皮细胞实验小鼠吸入异氟烷麻醉并断颈处死，75%酒精浸泡消毒 5 min，然后沿背部肾区剪开，置于预冷的DMEM 培养基中，反复冲洗。去除肾包膜和肾蒂组织，再用 DMEM 冲洗 2 3 次。剥离肾皮质，剪碎后与DMEM 培养基重悬移入离心管中，1 500 rmin1离心5 min。去除上清液，依次加入5 ml 型胶原酶和胰蛋白酶溶液，反复吹打后置于 37 摇床消化 30 min，然后用吸管将混悬液反复吹打数次，取新培养皿依次放上筛孔尺寸为 250 m 和 80 m 的筛网，双重过滤细胞。移入离心管 1 500 rmin1离心 5 min;去除上清液，获得细胞沉淀。使用 Abcam 公司抗体 Anti-panCytokeratin，搭配磁架分选肾小管上皮细胞，获得细胞沉淀后 PBS 清洗 3 遍，加入 1 ml Trizol 提取细胞总NA，送广东基迪奥生物科技公司测序，包括 mNA和微小 NA(miNA)Sequence。1 5细胞测序和生物信息学分析利用肾小管上皮细胞总 NA 合成 cDNA，构建Illumina 文库，然后高通量测序。生物信息学分析步骤包括原始数据处理(质量剪切、污染序列去除等)、序列比对和功能注释。筛选并分析染毒后变化倍数2 且P 0 05 的 mNA 或 miNA 为差异显著的基因，对差异基因进行 GO、KEGG 和 GSEA 功能分析，并探索差异 miNA 与 mNA 之间的靶向关系。生物信息学分析借助实时交互式在线数据分析平台 Omicsmart(http:www omicsmart com)进行。1 6统计学处理实验数据由经过统计学知识培训的工作人员采集和录入。用 Graphpad prism 8 0 软件统计分析并作图。定量数据以均数 标准差表示，中毒组与对照组小鼠检测指标的比较采用 t 检验，P 0 05 表示差异具有统计学意义。2结果2 1中毒组与对照组小鼠一般状态比较对照组小鼠大致正常，毛发光泽，自主觅食，反应敏捷。中毒组灌胃 12 h 后毛发松散，活动减少，进食和尿量均减少;24 h 后大部分小鼠毛发凌乱，停止觅食，反应迟钝;染毒 48 h 上述中毒症状加重，部分小鼠死亡，存活小鼠神情淡漠;72 h 存活小鼠精神有所好转，进食量增加，体重开始回升，7 d 后基本到恢复处理前状态。2 2中毒组与对照组小鼠血浆炎症因子、肾功能标志分子、肾脏 HE 染色与病理评分和 IF 染色情况比较敌草快中毒48 h 小鼠血浆炎症因子 IL-6 含量、肌酐和尿素氮浓度较对照组显著升高(图 1A)。肾脏形态学变化:对照组小鼠肾脏呈鲜红色，边缘平滑质韧，结构未见明显异常，皮质与髓质分界明显。中毒组小鼠肾脏明显肿胀，包膜紧张，色泽暗红质脆，表面有细小出血点，局部大片瘀斑;肾小管上皮细胞肿胀，部分空泡变性，偶见坏死，可见红细胞管型和蛋白管型致管腔狭窄甚至堵塞;皮质和髓质界限模糊不清，部分肾小球轻度肿胀，结构紊乱;间质充血伴炎症细胞浸润。中毒组肾脏病理评分显著高于对照组(图 1B)。IF 染色进一步提示中毒组小鼠肾脏单核巨噬细胞浸润较对照组增加，提示敌草快致肾脏组织炎性损伤(图 1C)。23中毒组与对照组小鼠肾脏上皮细胞 mNA 测序结果比较样本关系聚类和相关性 PCA 分析提示敌草快中毒后肾脏上皮细胞与对照组差异显著(图 2A、B)。中毒组1 925 种基因上调，3 858 种基因下调(图2C、D);促炎因子(TNF 和 MMP8)、趋化因子(CCL2、CXCL1 和CXCL2)和促凋亡分子(BAK、Tnfsf14 和 Caspase3)均显著增加。与之相反，抑炎因子(SOCS 和 TGF-)和抑制凋亡分子(BCL2)均显著降低(图 2E)。KEGG 功能分析提示差异基因在炎症信号通路(IL-17、NF-B、TNF、细胞侵入上皮细胞)和凋亡相关信号通路显著富集，比如磷脂酰肌醇 3 激酶-Akt(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt，PI3K-AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)434现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)a P 0 05A 两组小鼠血浆中炎症因子和肾功能标志分子的浓度;B 肾组织 HE 染色及相应的统计学结果，图中减号表示上皮细胞肿胀管腔狭窄，加号表示蛋白管型，乘号表示红细胞管型;C 肾组织 IF 染色及相应的统计学结果图 1敌草快中毒致肾脏炎性损伤信号通路(图 2F);差异基因 GO 功能分析也提示敌草快中毒后肾小管上皮细胞程序性死亡、氧化应激反应和炎症反应相关信号通路显著激活(图 3A)。借助GSEA 数据集进一步分析，发现敌草快中毒时肾小管上皮细胞分化和脉管系统发育等生理功能显著变化(图 3B、C)。2 4中毒组和对照组小鼠肾脏上皮细胞 miNA 测序结果比较基于样本关系聚类和相关性 PCA 分析，miNA 测序提示敌草快中毒后肾小管上皮细胞基因表达差异显著(图 4A C)，144 种 miNA 上调，146 种 miNA 降低(图 4D E)。本课 题 组 关 注 的 miNA-21 和miNA-30a 均显著升高(图4F)，我们前期证实这2 种miNA 参与炎症反应和细胞凋亡的调控13-15。KEGG 功能富集提示差异基因在炎症和凋亡相关信号通路(MAPK 和 Apoptosis)显著富集(图5A)。GO功能分析显示差异基因在细胞程序性死亡、氧化应激反应和上皮细胞形态与功能发育相关 Term 中显著富集(图 5B)。25中毒组小鼠肾小管上皮细胞显著差异 mNA 与miNA 的靶向关系分析我们进一步筛选测序提示染毒后显著差异的mNA 与 miNA 的靶向关系。借助研究 miNA 靶向分子常用的 3 个数据库 Miranda(3 3a)、Target Scan(7 0)和 NA hybrid(2 1 2)开展生物信息学分析，我们预测了兴趣分子 miNA-21 和 miNA-30a 的靶基因。预测到 miNA-21 潜在靶基因有3 360 个，包括显著差异的基因 MMP8 和 VCAM-1(图 6A)。本课题还预测到 miNA-30a 有 2 653 个潜在靶基因，包括本项目测序中显著差异的基因 BCL2 家族成员 BCL2L11(图 6B)。3讨论我国是发展中的农业大国，农药在生产中广泛使用，急性农药中毒发病突然且进展迅速，常引发多脏器功能障碍而危及患者生命16-18。敌草快是全球第三大灭生性除草剂，临床病例多为口服敌草快药液中毒，经消化道进入体内后敌草快主要分布于胃肠道、肝脏534李琳，等 多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制A 样本相关性分析;B 组间差异基因小提琴图;C 差异基因数量柱状图;D 差异基因火山分布图;E 热图展示不同组细胞内炎症和凋亡分子表达差异;F 差异基因的 KEGG 功能分析图 2肾脏上皮细胞转录组测序结果和肾脏8。中毒引起全身多脏器损害，包括严重肾损伤、胃肠黏膜溃疡、心源性休克和神经功能障碍。临床缺乏特效解毒药，患者病死率较高，敌草快中毒已成为危及民众生命健康的重大安全问题。敌草快中毒机制目前尚未完全阐明，有氧化应激损伤、神经变性和生殖发育毒性等学说8，19。目前多数学者认为敌草快是一种强氧化剂，主要毒理机制是通过氧化还原反应在细胞内产生过量的活性氧和活性氮，超过机体代偿能力，导致细胞损伤甚至死亡20-22。本实验敌草快中毒小鼠血浆检测和组织病理均提示染毒后促炎因子升高，肾脏损伤显著，证实肾脏是敌草快中毒的主要靶器官。患者肾脏活检和动物组织病理切片均提示敌草快中毒致急性肾小管坏死，红细胞管型和蛋白管型堵塞管腔，肾小球滤过率显著下降引发肾功能障碍23-24。但目前敌草快相关肾小管上皮细胞损伤病理机制的研究尚不充分25，分析中毒后肾小管上皮细胞显著变化的基因和信号通路，为深入探索肾损伤病理机制提供依据，也有助于临床治疗策略的优化从而改善预后。我们构建小鼠灌胃染毒模型，分选出肾小管上皮634现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)A 差异基因的 GO 功能分析;B、C GSEA 分析敌草快中毒时肾小管上皮细胞分化和脉管系统发育等生理功能显著变化图 3转录组测序差异基因功能分析细胞，通过多组学测序分析敌草快中毒时显著差异基因及其功能富集的信号通路。结果显示染毒后肾小管上皮细胞内 5 783 种基因 mNA 和 290 种 miNA 显著变化，其中促炎症因子 MMP-8 和 TNF、趋化因子CCL2、CXCL1 及 CXCL2 促凋亡基因 BAK、Tnfsf14 和Caspase3 的表达均显著上调，抑炎因子 NF-B 和SOCS 以及抑制凋亡分子 BCL2 均显著下调。功能分析进一步提示敌草快中毒后肾小管上皮细胞差异基因在程序性死亡、氧化应激反应和炎症应答相关信号通路富集，提示炎症反应和氧化应激导致肾小管上皮细胞凋亡可能是敌草快中毒肾损伤的重要病理机制。这与当前敌草快中毒患者的临床治疗策略相吻合，包括抗氧化、清除氧自由基和抑制过度炎症反应，常用药物包括 N-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、维生素 C 和糖皮质激素等8。此外，本研究中敌草快中毒后肾小管上皮细胞促凋亡分子显著上调加重了肾脏损伤，提示靶向干预 BAK 和 Caspase3 的抗凋亡策略有望成为精准治疗的新方法。除细胞凋亡通路激活外，敌草快中毒后肾小管上皮细胞的差异基因在 IL-17 和 NF-B 信号通路中也显著富集，提示 IL-17 和 NF-B 通路分子参与小鼠敌草快中毒肾损伤的病理机制。岑祥莹等11 报道在大鼠模型中 IL-17 可激活 NF-B 信号通路，诱发线粒体功能障碍导致肾脏损伤。NF-B 是细胞内重要的核转录因子，参与炎症反应、免疫应答和细胞凋亡。敌草快中毒时肾小管上皮细胞内过量的活性氧激活 NF-B，使得 IL-1、IL-6 和 TNF-等下游因子显著上调;这些促炎因子反过来进一步激活 NF-B，形成正反馈级联放大效应26-27，导致难以控制的细胞因子风暴28，引起急性肾损伤甚至肾衰竭。因此通过药物来特异性抑制 NF-B 信号转导通路，有望成为临床治疗敌草快中毒的新途径。本研究 miNA 和 mNA 测序均提示敌草快中毒后差异基因在 MAPK 信号通路显著富集，提示 MAPK734李琳，等 多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制A 样本相关性分析;B、C 组间和样本间差异基因小提琴图;D 差异基因数量柱状图;E 差异基因火山分布图;F 热图展示不同组细胞内 miNA 表达差异图 4小鼠肾小管上皮细胞 miNA 测序结果信号通路参与敌草快中毒的病理机制。MAPK 通路是细胞内多种信号转导的交汇中心，把胞外信号传递到胞内入核，发挥多种生物学效应，参与应激反应、炎症应答和细胞凋亡等重要的病理生理过程。国内多项研究29-30 证实，百草枯中毒可激活 MAPK 信号通路导致大鼠急性肺损伤，血必净和姜黄素通过抑制 MAPK 信号通路发挥抗炎、抗氧化作用，有助于减轻百草枯中毒相关肺损伤31-32。miNA 是由 20 24 个核苷酸组成的非编码NA，是遗传信息表达的重要调控分子。miNA 通过和靶基因 mNA 的碱基配对，引导沉默复合体降解目标 mNA 或阻碍其翻译33，在炎症反应和细胞凋亡生理过程中发挥关键作用。敌草快中毒时显著升高的miNA-21 和 miNA-30a 参与炎症反应和细胞凋亡的调控14-15。我们借助常用数据库预测了 miNA-21 和miNA-30a 的靶基因数据集，并匹配到敌草快中毒后834现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)A 组间差异基因 KEGG 功能分析;B 组间差异基因 GO 功能分析图 5miNA 测序差异基因功能分析肾小管上皮细胞中显著差异的基因 MMP8、VCAM1 和BCL2L11。有研究证实上述靶基因 MMP-8、VCAM-1和 BCL2L11 参与炎症反应和细胞凋亡的 病 理 过程34-37，接下来可以通过细胞学实验进一步验证miNA 与 3 个靶基因的调控关系。本实验利用测序数据分析了敌草快中毒后肾小管上皮细胞内显著变化的核心分子及其相互联系，有助于临床靶向药物的研发与应用。综上所述，我们基于敌草快中毒小鼠模型和肾小管上皮细胞多组学测序结果，发现染毒后肾脏显著损伤，促炎因子和促凋亡分子增加，抑炎和抑凋亡分子降低;除氧化应激反应外，细胞凋亡、IL-17、NF-B 和MAPK 等信号通路参与敌草快中毒相关肾小管上皮细胞损伤，为阐明敌草快中毒肾损伤的病理机制提供了科学依据。鉴于敌草快中毒发病率和死亡率均高，需进一步开发精准治疗措施优化现有临床诊疗策略，改善中毒患者的预后。934李琳，等 多组学测序分析敌草快致肾小管上皮细胞损伤的病理机制A 数据库预测 miNA-21a 靶基因的数量及重要的凋亡基因;B 数据库预测 miNA-30a 靶基因的数量及重要的凋亡基因图 6敌草快中毒时显著差异 mNA 与 miNA 的靶向关系 参考文献 1农业部种植业管理司 农业部、工业和信息化部、国家质检总局联合颁布的第 1745 号公告EB/OL 中华人民共和国农业部，(2012-04-24)2023-01-12 http:www moagov cn/govpublic/ZZYGLS/201204/t20120427_2613538 htm 2梁晓丽，刘善收，王仙琦，等 25 例敌草快中毒的临床特征分析 J 临床急诊杂志，2018，19(6):389-393 3梁晓丽，虎晓岷，龚阳，等 2016-2018 年间 40 例敌草快中毒患者的死亡危险因素分析 J 临床急诊杂志，2019，20(5):366-370，375 4王韫文，赵敏 71 例急性敌草快中毒患者死亡危险因素分析 J 中国医科大学学报，2022，51(3):203-208 5吴雨璇，张劲松，乔莉，等 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