CircPTTG1IP调控...增殖、迁移和炎症反应的影响_冷冬月.pdf
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1、现代医学Modern Medical Journal2023,Apr;51(4):454-46135(2):182-185 12 KHAN K,SAEED S,AMCHAAN A,et al A case series ofclosed head trauma with pituitary stalk disruption resulting inhypopituitarism J Int J Surg Case ep,2018,43:69-71 13WANG J Z,WITIW C D,SCANTLEBUY N,et al Clinicalsignificance of posttrauma
2、tic intracranial hemorrhage in clini-cally mild brain injury:a retrospective cohort study J CMAJOpen,2019,7(3):E511-E515 14 贾海勇,肖华,周俊甫,等 创伤性颅脑损伤患者继发感染的临床特点及危险因素 J 中国临床保健杂志,2022,25(4):489-492 15 王欢景,王华,何卫春,等 颅脑损伤并发垂体前叶功能减退的危险因素 J 中国临床神经外科杂志,2020,25(5):314-316 16 王碰起,高进喜,陈锦华,等 创伤性颅脑损伤早期患者ACTH 轴和 TSH 轴
3、激素水平及相关指标的变化J 中华神经医学杂志,2020,19(6):566-575 17 梁前垒,郭永川,李朝晖 重型颅脑创伤患者早期并发腺垂体功能减退的临床诊治分析J 中华内分泌外科杂志,2020,14(1):56-59 18 甄志勇,郭丽娟,薛增珍,等 重症颅脑损伤病人炎症反应与凝血机制特点分析J 中西医结合心脑血管病杂志,2020,18(18):3100-3104 19 王雅静,付之雄 重症创伤性颅脑损伤后垂体前叶激素水平异常的影响因素及其对预后的预测价值J 中外医学研究,2022,20(13):58-62 收稿日期2023-02-01 修回日期2023-03-27 基金项目湖北省卫生健
4、康委 20212022 年度科研项目(WJ2021F032)作者简介冷冬月(1985 ),女,湖北南漳人,主治医师,医学硕士。E-mail:ailwlt163 com 通信作者李旭峰E-mail:xnpev6j163 com 引文格式冷冬月,方兴刚,李旭峰 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响J 现代医学,2023,51(4):454-461 论著 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响冷冬月1,方兴刚1,李旭峰2 1 湖北省十堰
5、市太和医院(湖北医药学院附属医院)中西医结合科,湖北 十堰442000;2 十堰市人民医院 中医科,湖北 十堰442000 摘要目的:探讨 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎(A)成纤维样滑膜(FLS)细胞增殖、迁移和炎症反应的影响。方法:实时荧光定量聚合酶链反应(qT-PC)、蛋白质印迹法(Western blot)检测正常 FLS 细胞和 A-FLS 细胞中 CircPTTG1IP、mi-223-3p 表达以及 SMAD3 蛋白表达;双荧光素酶实验验证 Circ-PTTG1IP 与 mi-223-3p、mi-223-3p 与 SMAD3 的关系。
6、将 A-FLS 细胞分为 A-FLS 组、si-NC组、si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组、si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组,qT-PC 检测 A-FLS 中Circ-PTTG1IP、mi-223-3p 表达;CCK8 检测 A-FLS 增殖情况;流式细胞术检测 A-FLS 凋亡率;Transwell实验检测 A-FLS 细胞迁移及侵袭情况;Western blot 检测 SMAD3、EMT 相关蛋白表达;ELISA 法检测 IL-2、IL-6 水平。结果:与 FLS 组比较,A-FLS 组 CircPTTG1IP、SMAD3 上调,mi-
7、223-3p 下调;与 A-FLS 组、si-NC 组比较,si-PTTG1IP 组 OD 值,A-FLS 细胞迁移、侵袭数量,Circ-PTTG1IP、SMAD3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达,IL-6、MMP-2 水平均显著降低(P 0 05),mi-223-3p 表达、细胞凋亡率、E-cadherin 蛋白表达以454及 IL-2 水平均显著升高(P 0 05);mi-223-3p 沉默减轻了上述指标的变化;Circ-PTTG1IP 靶向调控 mi-223-3p/SMAD3 轴。结论:沉默 Circ-PTTG1IP 可能通过上调 mi-223-3p 来抑制 SMAD3
8、表达,进而抑制 A-FLS 增殖、迁移和炎症反应。关键词Circ-PTTG1IP;mi-223-3p;类风湿关节炎;成纤维样滑膜细胞增殖;迁移;炎症反应 中图分类号593 22 文献标志码A 文章编号1671-7562(2023)04-0454-08doi:10 3969/j issn 1671-7562 2023 04 005Impacts of CircPTTG1IP on the proliferation,migration andinflammatory response of rheumatoid arthritis fibroblast likesynoviocytes by r
9、egulating mi-223-3p/SMAD3 axisLENG Dongyue1,FANG Xinggang1,LI Xufeng2 1 Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Taihe Hospital(AffiliatedHospital of Hubei University of Medicine),Shiyan 442000,China;2 Department ofTraditional Chinese Medicine,Shiyan Peoples Hospital,Shiyan
10、442000,China AbstractObjective:To investigate the impacts of CircPTTG1IP on the proliferation,migration and inflammatoryresponse of fibroblast like synovial(FLS)cells in rheumatoid arthritis(A)by regulating mi-223-3p/SMAD3axis Methods:eal-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction(qT-P
11、C)and western blot wereused to detect the expression of CircPTTG1IP,mi-223-3p and SMAD3 protein in normal FLS cells and A-FLScells The relationships between Circ-PTTG1IP and mi-223-3p,mi-223-3p and SMAD3 were verified by dualluciferase assay A-FLS cells was divided into A-FLS group,si-NC group,si-PT
12、TG1IP group,si-PTTG1IP+anti-NC group,and si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p group The expression of CircPTTG1IP and mi-223-3p inA-FLS was detected by qT-PC;CCK8 was used to detect the proliferation of A-FLS cells;flow cytometry wasused to detect the apoptosis rate of A-FLS cells;Transwell assay was used to d
13、etect migration and invasion of A-FLS cells;Western blot was used to detect the expression of SMAD3 and EMT related proteins;ELISA was used todetect the levels of IL-2 and IL-6 esults:Compared with FLS group,CircPTTG1IP and SMAD3 were up-regulated,and mi-223-3p was down-regulated in A-FLS group;Comp
14、ared with A-FLS group and si-NCgroup,the OD value,the numbers of A-FLS cells migration and invasion,CircPTTG1IP,SMAD3,N-cadherin,Vimentin protein expression,IL-6 and MMP-2 levels in si-PTTG1IP group were significantly decreased(P 0.05),the expression of mi-223-3p,apoptosis rate,the protein expressio
15、n of E-cadherin and the level of IL-2were significantly increased(P 0 05);mi-223-3p silencing alleviated the changes of the above indicators;CircPTTG1IP targeted and regulated the mi-223-3p/SMAD3 axis Conclusion:Silencing CircPTTG1IP mayinhibit the expression of SMAD3 by up-regulating mi-223-3p,ther
16、eby inhibiting the proliferation,migration andinflammatory response of A-FLS Key words CircPTTG1IP;mi-223-3p;rheumatoid arthritis;fibroblast-like synovial cells proliferation;migration;inflammatory reaction类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,A)是一种慢性自身免疫性疾病,具有肌肉骨骼疼痛、肿胀和僵硬等常见症状,可损害患者的身体功能和生活质量1。滑膜组织是关节腔内的膜器官,
17、在 A 的关节破坏中起重要作用2。作为与滑膜组织形成相关的关键细胞,成纤维样滑膜(fibroblast-like synovial,FLS)细胞参与滑膜关节的炎症反应,进而导致 A3。此外,研究4 报道称 A-FLS 具有类肿瘤细胞的性质,如增殖、侵袭、迁移和抗凋亡。因此,探索 FLS 在 A 中的病理机制可能有助于找到治疗 A 的新方法。研究5 发现非554冷冬月,等 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响编码 NA 参与自身免疫和炎症,在 A 发展中发挥重要作用。环状 NA(CircNA)是一种封闭的非编码N
18、A,它可以通过与微小 NA(miNA)结合降低miNA 活性,进而增加 mNA 的稳定性,这在 A 疾病治 疗 中 起 关 键 作 用6。已 有 研 究7 发 现CircPTTG1IP 敲低可以抑制 A 的进展,而 Wu 等8 研究发现上调 mi-223-3p 可以抑制炎症因子表达进而缓 解 A。SMAD 同 源 物 3(SMAD homologue 3,SMAD3)在 A 患者中高表达,是 A 的潜在诊断生物标志物9。CircNA-miNA-mNA 轴在 A 中的作用已经被证实,如 circ_0088036 通过海绵化 mi-140-3p 和上调沉默信息调节因子 1(silence info
19、rmationregulator 1,SIT1)促进 A-FLS 的增殖和迁移10。Circ_0000396 通过 mi-203/HMG box 蛋白 1(HMGbox protein 1,HBP1)轴抑制 A-FLS 的生长和炎症反应11。而关于 CircPTTG1IP 是否通过调控 mi-223-3p/SMAD3 对 A-FLS 增殖、迁移和炎症反应产生影响尚未见报道,本研究探究了在 A 中的 mi-223-3p、SMAD3、CircPTTG1IP 表达模式以及 CircPTTG1IP-mi-223-3p-SMAD3 在 A 中的作用和机制。1材料与方法1 1细胞及主要材料FLS(货 号:
20、HT-X1905)、A-FLS(货 号:HT-X1835)购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司;si-NC、si-PTTG1IP、anti-NC、anti-mi-223-3p 购自上海生工生物工程有限公司;白细胞介素 2(IL-2)试剂盒(货号:IB-E10055)、白细胞介素 6(IL-6)试剂盒(货号:IB-E10049)购自江西艾博因生物科技有限公司;CCK8试剂盒(货号:SY0469-DN)、Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒(货号:WK304)购自北京百奥莱博科技有限公司;SMAD3 抗体(货号:ab208182)、MMP-2 抗体(货号:ab181286)、E-cadher
21、in 抗体(货号:ab40772)、N-cadherin 抗体(货号:ab98952)、Vimentin 抗体(货号:ab92547)购自 Abcam 公司。1 2A-FLS、FLS 细胞培养与分组将 A-FLS、FLS 置于 DMEM 培养基中培养,培养基中添加 10%FBS 和1%青霉素-链霉素,置于37,5%CO2条件下培养。待 A-FLS 培养至70%汇合时,参照 Lipofectamine 2000 试剂盒对 A-FLS 进行转染,分为 A-FLS 组(未处理的 A-FLS)、si-NC 组(si-NC转染 A-FLS)、si-PTTG1IP 组(si-PTTG1IP 转染 A-FL
22、S)、si-PTTG1IP+anti-NC 组(si-PTTG1IP6 和 anti-NC 同时转染 A-FLS)、si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p组(si-PTTG1IP 和 anti-mi-223-3p 同时转染 A-FLS)5 组,未处理的 FLS 记为 FLS 组,所有细胞均在细胞培养箱中培养 48 h 后用于后续检测。1 3双 荧 光 素 酶 报 告 实 验 检 测 mi-223-3p、SMAD3、CircPTTG1IP 关系将含有 mi-223-3p 结合位点的野生型 Circ-PTTG1IP/SMAD3 序列和不含 mi-223-3p 结合位点的突变型 Circ
23、-PTTG1IP/SMAD3 序列克隆到 pmirGLO 载体中,分别命名为 WT-PTTG1IP、MUT-PTTG1IP、WT-SMAD3、MUT-SMAD3,然后将上述序列与 mimic-NC或 mi-223-3p mimic 共转染到 A-FLS 中,分别记为mi-NC+WT-PTTG1IP 组、mi-223-3p mimic+WT-PTTG1IP 组、mi-NC+MUT-PTTG1IP 组、mi-223-3pmimic+MUT-PTTG1IP 组和 mi-NC+WT-SMAD3 组、mi-223-3p mimic+WT-SMAD3 组、mi-NC+MUT-SMAD3 组、mi-223-
24、3p mimic+MUT-SMAD3 组。培养48 h 后使用双荧光素酶检测系统检测 A-FLS 的荧光素酶活性。1 4qT-PC 检测 mi-223-3p、CircPTTG1IP 表达使用 Trizol 试剂提取细胞的总 NA,根据反转录试剂盒说明书合成 cDNA。根据 qT-qPC 试剂盒配制 20 l 反应体系上机扩增以测定 mi-223-3p、CircPTTG1IP 的相对表达量。反应条件为:预变性95、5 min,38 个循环(95、45 s,62、30 s),以U6 或 GAPDH 为内参基因,采用 2 ct计算 mi-223-3p、CircPTTG1IP 的相对表达量。引物序列见
25、表 1。表 1qT-PC 的引物序列基因正向序列反向序列mi-223-3p5-GGCGCTTTGTCAGTTTGTCAAAT-35-GTGCAGGGTCCGAGGT-3CircPTTG1IP5-AGGAACGGAGAGCAGAGATG-35-GCGTGCAGAGCTCAATTTAC-3U65-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-35-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3GAPDH5-GGAGAGTGTTTCCTCGTCCC-35-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG-3654现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月,51
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