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分子生物学

The Coming of Wisdom With Time
Though leaves are many, the root is one
Through all the lying days of my youth
I swayed my leaves and flowers in the sun;
Now I may wither into the truth.
---- William Butler Yeats (1916)

47

*绪论
进化论与细胞学说结合---现代生物学
1859 ,《物种起源》--Charles Darwin
“物竞天择，适者生存”
物种发生变异
将生物学归于自然科学的行列
19世纪中叶，细胞学说
动植物的基本单元是细胞
细胞成为生物学研究的首要对象
分子生物学在遗传学和生物化学的基础上诞生和发展
1857-1864，Gregor Mendel
奥地利的修道士，1865发表《植物杂交实验 》，1884去世，到1900年他的理论才被重新发现。遗传学的奠基人，对性状遗传产生了理性认识。
1910-1915, T.H.Morgan创立了遗传的染色体理论
以果蝇为材料。发现了遗传性状的连锁定律。
将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体联系起来。
对核酸的化学研究
1869年，瑞典的F.Miescher提取了细胞核中的中复合物，不溶于稀酸，可溶于稀碱，含磷的酸性物质，但由于在技术上未能进一步提纯，受到嘲讽，而最终放弃。核酸的化学研究在这之后的50年停滞，直到Avery的研究才有了突破。
1885—1900年间，Kossel、Johnew、Levine证实核酸最简单的单体结构是碱基-核糖-磷酸构成的核苷酸,有四种类型的碱基A T(U) C G。1929年又确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸(DNA)，另一种是核糖核酸(RNA)。
1928年，Griffith 肺炎双球菌的转化
英国人，为揭示DNA是遗传物质奠定了基础
第一个以令人信服的实验证明---基因的化学本质是DNA
1935--1944年，Oswald Avery 以肺炎链球菌为材料证明，DNA分子是遗传信息的载体。
诱导肺炎球菌类型转化的物质
的化学特性研究
<实验医学杂志>1944

1952年，Hershey和Chase 噬菌体感染实验获1969年诺贝尔奖

1956年,A.Gierer和G.Schraman发现 烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV），其遗传物质是RNA。

1957年,美国的Heinz Fraenkel-Conrat和B.Singre用重建实验证实了这一结论。

分子生物学的概念

广义：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的结构、功能及其相互作用的规律，从分子水平上揭示生命现象的本质及生物学规律的科学。
狭义:基因分子生物学/核酸分子生物学。在分子水平上研究基因的结构和功能。主要研究基因的复制、转录、表达和调节控制等过程。

*遗传物质的分子本质
朊病毒
1982年加州大学Stanley B.Prusiner 提出这种病由蛋白质侵染颗粒proteinaceous infectious particle（朊病毒）造成的；1991年Science提出唯蛋白学说，1997年获诺贝尔奖),

核酸病毒的繁殖一向是核酸作为遗传物质的重要证据，而朊病毒是不含核酸的蛋白质
病原体
朊病毒蛋白颗粒进入宿主细胞的“自我复制”繁殖，表明生物大分子的构型也是一种
可以传递的信息。
实验证明朊病毒的繁殖是将自身PrPsc的分子结构信息通过与正常膜蛋白PrPc的结
合，在分子伴侣的辅助下，传递给PrPc并将其转化为PrPsc
信息大分子的构型也是一种信息
DNA双螺旋二级结构的多态性

B型：正常生理条件，或92%相对湿度，一圈10个碱基，大沟宽，小沟窄。B－DNA是细胞内DNA的主要存在形式。
A型： 75%相对湿度或低温，一圈11个碱基，相对B型来说，大沟窄而深，小沟宽而浅。RNA局部双螺旋区均呈A构象，RNA-DNA杂交分子呈A构象。
Z型：左手螺旋，结构比B型细，只有一个沟槽。Z型构象与基因的表达调控有关。

a.增色效应（hyperchromic shift)
双链DNA缓慢加热，其溶液对紫外光的吸收值增加，该现象称～。
DNA溶液（50mg/ml）在260nm的吸光值：
双链DNA A260=1.00
单链DNA A260＝1.37
自由碱基 A260＝1.6

b.熔链温度（melting temperature,Tm)
DNA加热变性时，其紫外吸收光密度值达到最大值的一半时的温度，称熔链温度。

c. 影响Tm的因素-破坏DNA双螺旋的条件:
DNA的均一性（ Tm范围）
DNA的GC含量 (Tm＝0.41 x X% ＋ 69.3)
溶液的pH
溶液的离子强度（离子强度高， Tm高）中和磷酸骨架的负电性。
有机溶剂：尿素、甲酰胺、甲醇、甲醛（使Tm下降）
一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素均将使Tm 值降低
影响复性速度的因素
a DNA分子的复杂性（复杂性高，复性慢）
表示核酸分子非重复碱基对的数目。
b DNA浓度（浓度高，复性快）
c DNA片段的大小（片段越大，复性慢）
d 温度的影响 Tm - 25℃ (60-65℃)
e 溶液的离子强度 消除polydNt 间的静电斥力

C0t值: 复性单链DNA起始浓度和经过的复性时间的乘积。
C0t曲线:当DNA初始浓度、温度、离子强度、DNA片段大小确定后，以C/C0对logC0t 作图，得C0t曲线。
C0t1/2：复性程度达到一半时的 C0t值。从C0t曲线上可以求得C0t1/2。 C0t1/2直接反应DNA顺序的复杂性。

COt1/2 有什么用处?
(1) 通过COt1/2值可测原核生物基因组的大小；
已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec
COt1/2 （任何基因组DNA）/9M.sec
= 任何基因组大小/4.2X106bp
(2)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同；
(3) 可用以区分真核生物和原核生物基因组。

*基因,基因组和基因组学
转座因子：基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。需要转座酶的帮助

Pseudogenes假基因：核苷酸序列与相应的正常功能基因基本相同，但不能合成出功能蛋白，这些失活的基因称为假基因。

C值 (C-value)： 一个单倍体基因组的DNA的总量，通常称为该物种的C值(大C值)。
小c值: 编码结构基因DNA的核苷酸数.
拿每一类生物中的最小基因组做比较，每类生物的最小基因组的大小基本上对应于生物在进化上所出地位的高低，进化地位高，形态结构复杂程度高的一类生物，其最小的基因组也较大。
C值矛盾：生物形态学的复杂性与C值大小不一致，。
1 与预期的编码蛋白质的基因数量相比,基因组DNA的含量过多.
2 一些物种之间的复杂性变化范围并不大,但C值却有很大的变化.
N值矛盾： 生物体的复杂性与基因数之间并不总是正相关。
K值矛盾： 生物体的复杂性与染色体数之间并不总是正相关。
心脏叶瓶尔小草染色体数1260

重叠基因
1977年Sanger首先发现重叠基因
他对单链环状的噬菌体FX174进行了测序。 5386Nt 11 基因， 3个转录单位，由3个启动子（pA,pB,pD）启动。
FX174含有的5386Nt最多能编码1795个氨基酸，若每个氨基酸的平均分子量为110，则总的蛋白质分子量为197,000Da，但实际蛋白质总分子量却为262,000D。
将全部DNA顺序和蛋白质的氨基酸顺序进行比较，发现了重叠基因。
重叠基因：指调控具有独立性但部分使用共 同基因序列的基因。
基因间共同使用部分空间，但编码产物可以互不相关。（不同阅读框，不同的编码链）。
提高遗传物质的使用效率,仅在少数原核生物中发现。
断裂基因
R环的发现：
1977年，冷泉港学术年会，Berget和Roerts小组发现，在腺病毒（adenovirus）复制期间，位于感染细胞核中病毒RNA转录本的前体，由于移去了一至数个中间片段而缩短变成分子量较小的mRNA分子，它们转移到细胞质中成为合成蛋白质的模板。

内含子（intron）在初始转录产物 hnRNA 加工产生成熟的mRNA时，被切除的非编码序列。
外显子（exon）在成熟的mRNA或蛋白质中存在的序列。

高度重复序列（上万到数百万次）(highly repeated sequence)
在基因组中重复～106－107次，简单的高度重复序列：长度<10 bp
复杂的高度重复序列：长度>100 bp
一般不分散，串联成簇排列在异染色质，特别是在着丝粒和端粒附近
缺乏转录必需的启动子，一般不转录
简单的高度重复序列 卫星DNA (satellite DNA)
CsCl密度梯度离心时，出现在覆盖一定浮力密度范围的宽带（主带）的附近，呈一条或几条小带
均是高度重复序列，串联排列
以大的基因簇（100-3000kb）位于异染色质中（着丝粒），不转录
富含A/T，浮力密度小
*小卫星序列（minisatellite）
以小基因簇的形式，重复单位串联排列，小的基因簇（ 在100bp-10kb之间)，
有两种形式，一种为端粒DNA，一种为高度可变的小卫星DNA （variable number of tandem repeats，VNTR序列，可变数目串联重复）位于亚端粒区域，
重复的拷贝数在个体间的差异很大（VNTR loci and DNA fingerprints）
*微卫星序列（microsatellite sequence）
更小的基因簇（<200bp），重复单位小于10bp
均匀分布于常染色质上
个体间差异大，高度的多态性，呈共显性遗传，侧翼序列非常保守
*DNA Fingerprinting
由于小卫星和微卫星的重复次数在不同个体中高度可变，这种特定的重复次数就成为某一特定个体的特征。
DNA fingerprinting 可以用来鉴定个人与其家族的亲缘关系。
应用：法医学鉴定 遗骸识别 亲子鉴定 物种进化及起源的应用 疾病诊断及癌症研究
"DNA指纹"这个名称的由来：
1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。

中度重复序列（几十到几千次）
中度重复序列(10-数10万)包括: 编码序列和非编码序列
编码序列: rRNA基因、组蛋白基因
非编码序列: 逆转录转座子,包括短散布元件SINES（short interspersed element)（150-300bp）和长散布元件LINE(long interspersed element)（5-6kb）,重复上千次。
分散在基因组中，许多中度重复序列与单拷贝序列和低度重复序列相间排列。
非编码的中度重复序列，在进化中起着重要的作用。
SINE--Alu家族

DR
DR
IR
IR
AGCT
Alu site

人类基因组中存在最广泛的中度重复序列，平均长度约300bp，拷贝数30～50万，均匀地散布在整个基因组中。

低度重复序列（2-10次）每一种在基因组中的重复次数为2～10，多为编码蛋白质的基因
某些重复序列的核苷酸顺序不完全相同

单拷贝序列 (single copy sequence)
在基因组中只存在一个拷贝， 复性最慢。
编码真核生物绝大部分蛋白，表达具有时空特异性。

基因家族（gene family）：一组功能类似、结构具有同源性的基因。

细胞器基因组
1950s, 为了解释某些表型特殊的遗传方式，提出了²extra-chromosomal genes²。1960s早期（1962年〕，Ris and Plant 通过电镜首次证明叶绿体中含有DNA，用DNA酶处理，超薄切片的2.5~3.0mm的纤丝消失，进一步在电镜下观察到环状DNA分子。几乎所有的真核生物有线粒体基因组；所有的光合真核生物含有叶绿体基因组；一般来讲，细胞器基因组DNA呈环状，也有线状（一些真核微生物酵母等的线粒体基因组都呈线状；有的环状和线状并存，叶绿体中还有小环DNA分子存在.
存在复杂的RNA加工反应，包括切割，顺式-，反式-剪接，RNA的编辑和降解。
在线粒体中，RNA编辑改变DNA密码子的程度在3%-15%。

叶绿体基因组（chroloplast DNA, ctDNA)

线粒体基因组 (mitochondria DNA, mtDNA)

料
一、 DNA的生物合成

1、酶学基础
A 超螺旋构象变化及与解链有关的酶和蛋白
a. 拓扑异构酶II型 (引入负超螺旋)
Ⅱ型酶（Topoisomerase II）由ATP的水解提供能量，在DNA的双链上产生切口，
使另外一条双链DNA得以穿过 。
原核：gyrase （促旋酶Gyrase）利用ATP水解提供能量，向DNA分子引入负超
螺旋，从而抵消DNA复制中产生的正超螺旋。

真核：TopoⅡ
*Topoisomerase I:在DNA的一股链上产生一个切
口，使另一条链得以穿越 。

b. 解链酶 helicase(打开DNA双链)
催化DNA双螺旋解链, 具有解链的极性和移位酶活性。

原核：DnaB (5’ ®3’)六聚体 ATPase
Rep (3’ ®5’) 单体，UvrD
真核：与pol d共纯化因子(5’ ®3’)
与pol e共纯化因子(3’ ®5’)

c. 单链DNA结合蛋白 (保持单链状态)
原核：单链结合蛋白SSB (single strand binding protein)
真核：复制蛋白A RPA /复制因子A RF-A
B 引发酶（primase） 作用: 合成RNA引物

E. coli : DnaG 基因编码，是一种特殊的RNA聚合酶，其引发活性依赖于
DnaB(解链酶)蛋白。
真核生物： pol a的p49 p58亚基具有引发酶的活性。
C DNA聚合酶（DNA polymerase）
主要用于复制的DNA聚合酶：原核: DNA聚合酶
III
真核: pol ( RNA引物的合成)
pol d/ pol ε (DNA的复制)
PCNA (滑动钳)
RFC (钳载复合物)

原核a. DNA聚合酶I
大片段（klenow片段）：
5’®3’聚合酶活性(中等)
3’®5’ 外切酶活性(校对)
小片段：5’®3’外切酶活性(切RNA引物)
主要生物学功能：除去RNA引物时，后滞链的修
复；DNA损伤的修复。
应用：缺口翻译
DNA聚合酶 I不是DNA复制的主要聚合酶
*1969年，Paula Delucia和John Cairns分离得到的
E.coli 突变菌株polA-，其DNA pol的活性只有正
常菌株的1%，但是仍然可以正常分裂。
DNA pol I的聚合反应速度为103base/min， 原
核生物实际的复制速度为105 base/min。
DNA pol I的进行性（processivity）不高。
b. DNA聚合酶II
5’®3’聚合酶活性 ；
3’®5’ 外切酶活性
生物学功能： 与DNA聚合酶 I 类似 ，可能在DNA损伤修复中起作用。
c. DNA聚合酶III
多亚基组成 ，5’®3’聚合酶活性（1000Nt/s），3’®5’ 外切酶活性
主要生物学功能：DNA复制所必需
1 核心酶: 包含主要的酶活性
2 钳载复合物
3 滑动钳: 提高酶持续合成的能力
processivity 50Kb
τ亚基二聚化
合成速度：体内1000nt/s
体外700nt/s
聚合酶III的校对功能

1碱基错配，polIII停顿。

2错配碱基移动到外切酶活性中心，被
切除。

3继续DNA合成

DNA聚合酶Ⅲ的组装
后随链的合成需要β滑动钳周期性的装配和解体

真核生物DNA聚合酶：四种细胞核DNA聚合酶
a ：无 3’®5’ 外切酶活性，引物酶
pol a是真核生物DNA复制的主要酶类，主要负责RNA引物的合成。
由4种亚基构成，p180、p70、p49、p58、P180具有DNA聚合酶的活性， p49、 p58具有引物酶（primase）的活性。pol a的持续合成能力较差，合成40nt 的RNA-iDNA后就从DNA模板上脱离。且没有校正功能。

b ：无 3’®5’ 外切酶活性

d ：有 3’®5’ 外切酶活性，后随链合成
pol d是真核生物DNA复制的主要酶类，主要负责后随链的合成。pol d的持续合成能力强，且具有3’®5’ 外切酶活性（即校正功能）。PCNA（proliferating cell nuclear antigen 增殖细胞核抗原）可以促进pol d的持续合成活性，相当于原核pol Ⅲ的β亚基。（processivity factor）PCNA相当于原核pol Ⅲ的β亚基。RFC：复制因子C，相当于γ复合物。特异结合于引物-模板复合物，再与PCNA结合，最后结合pol δ.

e ：有 3’®5’ 外切酶活性，前导链合成
pol ε前导链/pol d后随链是真核生物DNA复制的主要酶类，主要负责DNA的合成以及DNA的切除修复。pol ε的持续合成能力强，且具有3’®5’ 外切酶活性（即校正功能）。
pol ε 的活性不依赖于PCNA。
一种线粒体DNA聚合酶：有 3’®5’ 外切酶活性
真核DNA聚合酶均无5’ ®3’外切酶的活性，由FEN1（flap endonuclease, 以前简称
MF1）和RNaseH完成引物的切除.
D 核酸酶（nucleases）作用: 切除RNA引物
核酸外切酶exonuclease—末端降解
核酸内切酶exdonuclease—内部切割，序列特异
1、 E. coli : DNA聚合酶I/ RNaseH
2、真核生物： FEN1（flap endonuclease, 以前简称MF1）和RNaseH1
E DNA 连接酶（DNA ligase）作用: 连接相邻核苷酸
大肠杆菌DNA连接酶：NAD
真核DNA连接酶: ATP
哺乳动物中至少有四个，其中I是涉及后滞链的修复的基本酶。
T4DNA连接酶: ATP
DNA-DNA: 单链切口、双链粘性末端、平头双链
RNA-RNA连接
*细菌和真核复制体的成分比较

细菌
真核
拓扑异构酶
DNA gyrase
topo II
解链酶
DnaB
多个
单链结合
SSB
RF-A
复制多聚酶
pol III全酶
pol d/ ε
进行性因子
b亚基
PCNA
引发酶/引物酶
DnaG
pol a的两个亚基p48 p58
引物去除
RNaseH和pol I
FEN1和RNaseH
后滞链修复
pol I 和DNA连接酶
pol d/ e和DNA连接酶
Rf.高级分子生物学要义，p367表26.10

二、 DNA复制的详细机制

原核1、复制的起始
a复制的起点和方向
E.coli 复制起始点在DNA分子特定的位点，整个染色体只有一个复制起始点
OriC，复制是双方向进行的。E.coli 复制起始点有特殊的序列特征。复制起始包
括: 对Oric 的识别,引发体的形成。
大肠杆菌复制起始点：OriC 长度：245 bp
重复序列：
a. 9 bp序列： -TTATNCANA 五个拷贝，
为DnaA蛋白结合位点。
b. 13 bp序列： -GATCTNTTNTTTT-，
三个拷贝，富含AT。

b 引发

DnaA结合于oriC中的9bp重复序列，并
促使3个13bp的重复序列发生解旋，HU蛋白和整合宿主因子IHF起帮助作用。 DnaA引导DnaB-DnaC复合物进入解链 区，并由DnaB(解链酶)继续解链。DnaC的功能是将DnaB运送到复制模板。

3、 链的延伸（拉管模型）
Pol Ⅲ同时催化前导链、后滞链合成。
前导链先于后滞链合成一个片段（落后）。
后滞链模板折返180度，使两条新生链都是5’-3’的方向。
聚合酶与DNA发生反复性的解离与结合：当后滞链完成一个冈崎片段的合成，即与Pol Ⅲ分开。同时，前移的引物酶已合成新的RNA引物，后滞链模板再次折返180度，进行下一个冈崎片段的合成。
Trombone model

4、 链的终止

终止区（terminus region, ter）：有6个Ter
位点，富含GT。
终止区结合蛋白（Tus）：反解链酶，抑制
DnaB的解链。
复制叉在终止区相遇后，复制停止，复制体解聚。
子代双链DNA分子在拓扑异构酶IV的作用下分开。

*Segregation子链分开
Topoisomerase IV 拓扑异构酶
Xer CD 位点特异性重组酶

*环状DNA复制的几种方式
q复制（E.coli）
= Cairns复制(1963)
= 大肠杆菌双链环状DNA
= 双向复制

滚环复制（噬菌体phage） D环复制（细胞器ct mt）

真核：线性DNA的复制
材料：酵母，SV40病毒a. 核小体障碍b. 复制速率低, 冈崎片段短c. 多复制起点，双向复制d. 复制发生S期,在一个细胞周期只进行一次 e.端粒DNA的复制（线性DNA的末端复制）
a复制的起点和方向
多复制起点，双向复制：真核的复制起点到两边的复制终点称为一个复制子（replicon)
或一个复制单位（replication unite).
复制起点利用的时机由其所处的染色质结构和DNA序列决定。
酵母中有自主复制序列
ARSs (autonomously replicating sequence)
核心序列11 bp, AT-rich
b、引发
1 pol α-引发酶在复制叉上先合成8-12个bp的RNA引物。
2 利用DNA聚合酶活性将RNA引物继续延伸---initiator DNA，RFC立即与之结合。
3 RFC促进PCNA的结合，继而polδ结合，持续合成DNA。--DNA聚合酶α/ δ的转换， pol α离开模板。

C 、链的延伸
PCNA促进polδ持续合成DNA。（包括前导链和后滞链）
FEN1/MF1和RNaseH切除RNA引物。

*端粒DNA的复制（线性DNA的末端复制）
半不连续复制机制不能完成真核线性染色体末端的复制。
端粒是染色体两端的一种特殊结构，它对于维持染色体的稳定性和线性DNA的顺利复制非常重要。端粒—位于真核生物染色体末端，由数百个简单重复序列构成。
端粒结合蛋白：
1.保护作用
2.招募端粒酶

端粒酶（telomerase）
端粒的复制不同于正常的DNA复制，是由端粒酶（telomerase)来完成的，它是一种特殊的逆转录酶。端粒酶是一种含RNA的蛋白质，RNA长159个碱基，其核心序列为
5 ‘ -CAACCCCAA- 3 ’是复制端粒DNA的模板。

原核：DNA复制的调控
原核细胞DNA复制起始的调控: Dam甲基化酶、 DnaA蛋白、 Oric中的GATC
只有在子代OriC处的GATC全部被甲基化后,才能重新启动新DNA复制.

OriC半甲基化时,抑制蛋白与OriC结合,使之无法被DnaA识别,完全甲基化后,抑制蛋白解离, DnaA识别OriC,启动DNA复制.

二、 DNA的转录

基因转录的基本特征：
（1）选择性的对部分基因进行转录；
（2）以DNA的一条链为模板(不对称转录)，以核糖核苷三磷酸 （rNTP）为底物，RNA聚合酶起催化功能；
（3）按5’—3’方向合成；无需引物的存在能单独起始链的合成；
（4）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在，通常为嘌呤A或G；
（5）转录在起始水平受到严格调控,转录具有高度忠实性.
不对称转录（asymmetrical transcription)：
有意义链(sense strand)/编码链(coding strand)/(+)链: 非模板链，核苷酸顺序与转录生成的RNA一致。
反意义链(antisense strand)/ 模板链(template strand)/(-) 链: 双链DNA中用作转录模板的那条单链，其核苷酸顺序与转录生成的RNA互补。
RNA聚合酶（RNA polymerase）：
依赖DNA的RNA聚合酶/RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase）
依赖RNA的RNA聚合酶（RNA－dependent RNA polymerase）
独立于模板的RNA聚合酶（template-independent RNA polymerase）
原核：

1、 原核生物RNA聚合酶：
全酶组成：a2 b b’ w s
全酶分子量：465 kD
核心酶： a2 b b’ w
s因子:有多种
Zn原子
抑制剂：肝素、利福霉素起始、利链霉素延伸

亚基
功能
a
N端参与全酶组装、C端参与和调节蛋白相互作用以及和增强元件结合

参与底物NTP的结合，催化磷酸二酯键的形成

带正电,与DNA模板结合

与b亚基构成催化中心,稳定b’的结合,在体外为变性的RNA pol成功复性所必需

识别启动子，提高RNA聚合酶与启动子的特异性结合

2、 启动子(promoter) E.coli 不同的s因子识别不同的启动子
原核启动子：RNA聚合酶识别并特异地与之结合完成起始反应的DNA序列。
上游（upstream）：从转录起始点起逆转录方向的核苷酸序列，依次用－1，－2等表示，通常为转录调控区。
下游（downstream）：
即转录区。转录起始点（＋1）开始顺转录方向的核苷酸序列，依次用＋2，＋3等表示。
核心启动子（core promoter）:
RNA聚合酶能够直接识别、结合的启动子。长度：> 40 bp
转录起始点：90％为嘌呤，CAT
共有序列（consensus sequence):
-10 区（-10 sequence/ Pribnow box）：解链区富含AT，影响开放起始复合物形成的速度，决定转录方向.
-35 区 (-35 sequence/Sextama box)
RNA聚合酶全酶依靠s因子的最初结合位点，影响起始的效率，在很大程度上决定了启动子的强度。
-10区与-35区的间距：90％为16～18bp
有些15 / 20bp
最适为17bp

启动子上游部位（upstream part of promoter UP）:
是RNA聚合酶结合或其所需要的蛋白质辅助因子的作用位点。

* 因子对RNA聚合酶与DNA结合的影响核心酶与DNA有一定的亲和力，这种亲和力主要来自蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间的静电引力，是一种与DNA序列无关的非特异性结合，这种结合又称为松弛结合（loose binding site).松弛复合物的半衰期约为60分钟。
由于核心酶与DNA的高度亲和力的存在，细胞中只有少量的RNA聚合酶是以游离状态存在，这对于转录能够高效起始非常重要。
s因子使RNA聚合酶全酶对非特异性位点的结合能力，结合常数下降104倍。
因子同时使RNA聚合酶全酶和启动子的结合非常紧密，结合常数增加1000倍。

转录过程的四阶段
1、模板识别
模板识别：核心酶在s 因子的参与下与模板DNA松散的可逆地结合，搜索启动子。 s 因子使RNA聚合酶对特异性位点的亲和性大大提高（106）。识别部位在－35区，全酶与启动子结合形成²封闭的启动子复合物² (closed promoter complex)
开放的起始复合物：全酶与－10区紧密地不可逆地结合，－10区局部解链，聚合酶构象改变，形成开放的起始复合物² (open-promoter complex)。
2、起始
第一个被转录碱基的选择（G/A）及三元复合物(全酶－启动子－核苷三磷酸)的形成。
无效起始（abortive initiations)

起始终止：RNA聚合酶成功延伸核苷酸链（ > 9bp），RNA聚合酶离开启动子位点，s 因子与核心酶解离.
3、延伸
转录泡（transcription bubble）：转录位点的动态、短暂的解链结构。转录泡的长度为15bp。
形成延伸三元复合物（核心酶－DNA－新生RNA）
RNA－DNA杂交区的长度为8～9bp。

影响RNA延伸速度的因素-暂停 倒退 阻滞：
细菌转录的速度约40bp/s（37°C），与翻译速度15 a.a/s 相当。
暂停信号：GC富集区/反向重复序列，链延伸的速度降低/暂停.
暂停的意义:同步化转录和翻译,利于转录调节蛋白发挥功能,或是转录终止所必须.

4、终止(termination)
不依赖r因子的终止
结构特征：
具有一个反向重复顺序，茎环富含GC，转录后形成稳定的茎环结构。
茎环后有数个A/T，转录后形成一串A－U配对的杂交链，稳定性差。

依赖r因子的终止r
因子利用位点 rut（40Nt单链）
具有依赖RNA的ATPase活性，利用水解ATP的能量，使附着在新生RNA链的r因子延5¢®3¢方向朝RNA聚合酶移动
具有5’®3’解旋酶活性，使RNA与DNA之间的配对碱基解离，使RNA新生链离开模板。

真核：DNA转录
1、真核生物RNA聚合酶
RNA聚合酶
细胞中的分布
转录产物
-鹅膏覃碱的敏感性
I
核仁
rRNA（18 S、28 S、5.8 S）
不敏感
II
核质
mRNA、snRNA、snoRNA
敏感
III
核质
tRNA、5 S rRNA、snRNA 、 其他小RNAs
中等敏感
(种属特异)

有复杂的亚基组成：14～17个亚基
核心亚基：相当于β’、β、α
共同亚基和特异亚基
分子量: 500 kD ～ 700 kD
需多种转录因子的参与才能显示起始活力

转录因子：
转录必需但不是RNA聚合酶组成成分的蛋白因子 。
针对不同基因 ： 普遍性（通用）转录因子
基因特异性转录因子
顺式作用元件（cis-acting elements）：转录因子结合位点的DNA序列
反式作用因子（trans-acting factors）： 转录因子

2、 RNA聚合酶 II
RNA聚合酶II的最大亚基的含有一段7个氨基酸的重复序列，被称作羧基末端结构域（carboxyl terminal domain, CTD ），CTD结构域中，Ser/Tyr可