亲和色谱精讲.ppt

4.3亲和色和色谱(层析析)AffinityChromatography,AC第一节概述原理利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性1.二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质；基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）2.3.4.亲和和层析析过程演示程演示5.z亲和吸附剂的构成载体（基质）、配体、连接臂6.说明：1.偶联用Gel（须是活化偶联介质）2.亲和吸附剂高度专一亲和吸附剂类专一亲和吸附剂3.按相互作用力划分：次级键亲和色谱配位键螯合色谱共价键共价色谱疏水键疏水色谱7.亲和层析的必要条件:z合适的配体（配基、ligand)z合适的载体（Matrix)z合适的吸附和洗脱条件8.第二节亲和色谱配基(ligandL)作为配体的条件亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活常用系统酶:底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸:互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素:受体、运载蛋白抗体:抗原、病毒、细胞外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞9.亲和层析常用配体配体目标分子配体目标分子5-AMPNAD依赖性脱氢酶、ATP依赖性激酶Poly(U)真核mRNA、Poly(U)结合蛋白ATPATP依赖性激酶凝集素糖蛋白NADNAD依赖性脱氢酶蛋白质A/蛋白质GIgG或IgG对应抗原NADPNADP依赖性脱氢酶苯基硼酸盐糖蛋白钙调蛋白钙依赖性酶Cibacron Blue F3G-ANAD(P)依赖性脱氢酶、激酶、磷酸酶、白蛋白、干扰素肝素某些凝固蛋白、血浆蛋白、脂蛋白、核酸相关酶、受体等Procion Red HE-3BNAD(P)依赖性脱氢酶、干扰素、抑制蛋白、纤溶酶原单克隆抗体特定抗原赖氨酸纤溶酶、纤溶酶原、纤溶酶原激活剂过渡金属离子含组氨酸的多肽或蛋白质10.配体的浓度z一般使用一般使用较高的固定化配体高的固定化配体浓度度z配体配体亲和力高，且本身和力高，且本身带电则浓度度须降低降低z配体配体浓度度过高引起色高引起色谱畸畸变。(与很多物与很多物质发生非特异性生非特异性结合合)11.配体的配体的选择1.考虑亲和势L+SLSKl=LS/LS要求Kl在10-410-8mol/L之间2.与L的偶联不破坏L与S的结合3.需了解L-S的作用机制如12.z例：例：酶有有单底物反底物反应、双底物反、双底物反应z单APEEEAEP底物A、产物P或它们的类似物都可以13.双底物依次双底物依次zABPQEEEAEABEPQEQ须选择A、若选B则吸附时须加A14.双底物随机双底物随机zA（B）B（A）P（Q）Q（P）EEEAEA（B）EPQA、B都可选择对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。15.第三第三节亲和和层析析载体体一、作一、作为载体的条件体的条件1.亲水2.惰性3.具有活化基团4.大网孔5.机械性能好16.二、二、载体的体的选择1.琼脂糖凝胶：亲水性强，理化性质稳定（商品名：Sepharose）2.聚丙烯酰胺凝胶：理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.葡聚糖凝胶：有良好的化学及物理性质，孔径小。4.纤维素：非特异吸附严重，廉价，易得。5.多孔玻璃：物理性能好，有非特异性吸附。17.三、手臂（Spacerarm）在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。示意图如下：18.19.20.z连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂疏水性手臂（其长短对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂水性手臂（其长短对吸附的影响不大）；z疏水性手臂具体选择应考虑：分离物质分子量大小亲和势大小过长手臂易弯曲、折叠等；z最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3-二氨基二丙胺。21.22.接有接有连接臂的接臂的亲和和层析用析用载体体载体连接臂供应商琼脂糖3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基Bio-Rad3,3-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基Bio-Rad1,2-二氨基乙烷,1-二氨基己烷,3,3-二氨基二丙胺ICN1,6-己二胺,6-氨基己酸Pharmacia3,3-二氨基丙基胺,对苯甲酰基-3,3-二氨基丙基胺Serva氨基烷基(2,4,6,8,10)Miles聚丙烯酰胺-琼脂糖1,6-己二胺,6-氨基己酸IBF多孔玻璃氨基丙基,氨基己基Merck23.第四第四节亲和吸附和吸附剂的制的制备一、要求.L与基质结合，对L-S结合无干扰；.L为小分子有的需“手臂”，使L-S结合更有效；.非专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。24.二、二、偶偶联用用Gel的的选择需考虑：.L上可供偶联的基团.“手臂”.L的稳定pH三、三、由由CNBr活化型活化型Sep.4B制制备商品名：CNBr-Sepharose25.一般步一般步骤：冻干粉溶胀洗涤混合反应掩蔽溶 解 L 洗去L（未结合）成品26.溶胀和洗涤用1mol/LHCl溶胀洗涤除细碎粒子.偶联条件注意：前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH.掩蔽偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。.洗去未结合L用高-低交叉pH来洗（45次）27.亲和吸附剂的制备过程28.封闭未反应的活化基团z载体上活化基团浓度525mol/mlz偶联上的配体浓度110mol/mlz封闭试剂pH8.0，1mol/L乙醇胺甘氨酸巯基乙醇室温反应1h29.配体配体浓度度评估估z差示分析法z直接测定法z放射分析法z水解法连接臂的接臂的连接接z连接臂先接配体后偶联至载体z连接臂先偶联至载体后接配体30.四、四、由氨基-Sep或羧基-Sep制备Sep-(CH2)6-NH2L-COOHAH-SepSep-(CH2)6-COOHL-NH2CH-Sep碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：31.琼脂糖等多糖类载体z溴化氰法最常使用，简单温和，活化效率高，速度快；反应可逆，剧毒，可能带上电荷32.z双环氧法(p140-145)产生亲水连接臂，不带电荷，稳定，偶联配体数量少于溴化氰法33.z二乙烯砜法反应性能强，适合于偶联羟基配体；剧毒，昂贵34.zN,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯法稳定，不带电荷35.z有机磺酰氯法对甲苯磺酰氯、三氟代乙磺酰氯可释放生色基团，可用于监测偶联反应36.z碳化二亚胺交联法37.其他方法z羰基二咪唑（CDI）法z高碘酸盐法z磺化氟甲基吡啶鎓法zN-羟基琥珀酰亚胺法38.其他亲和吸附剂z聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固定到其活化基团上;z硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团.39.z戊二醛法OHC(CH2)3CHO与载体酰胺基团结合，并与配体氨基结合简单、便宜、稳定，引入连接臂，有中等毒性z肼解法-CONH2CONHNH2CON3CONH-LNH2NH2NaNO2L-NH240.类专一性亲和吸附剂.固定化凝集素（本质是蛋白质）可用来分离糖、糖蛋白如.固定化多聚核苷酸可用来分离NA、核蛋白如.染料亲和吸附剂以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等41.42.第五第五节一般一般实验方法方法是否有类专一吸附剂有溶胀Gel无选L选偶联Gel偶联L装柱43.安装安装仪器器平衡（平衡（23Vt）加加样吸附吸附洗去非吸附物洗去非吸附物亲和柱和柱洗脱液洗脱液再生再生脱脱盐44.一、亲和吸附柱的预备.亲和吸附剂选择或制备效能小试：据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t.用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸附性能好，0.9.不断加样到目的物流出，确定吸附容量.柱H/D高度专一短类专一长平衡一般23Vt始缓45.二、二、加样吸附.样品平衡（透析或SephadexG-25）.样品体积Vs（一般5%）若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小.洗去非吸附物（10Vt始缓洗）三、洗脱（以S不变性为前提）类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。46.样品准备加样前样品应当澄清，不含颗粒状物质，有适当的pH值、离子强度以利于目标分子的结合z离心（10000rpm）或过滤（0.45或0.22m滤膜）除去不溶物z对复杂样品如组织细胞、植物材料、发酵产物，应预处理，如超声破碎、溶解、均质、抽提、过滤、离心等z盐析、离子交换层析z透析或凝胶过滤完成脱盐、缓冲液交换47.加样吸附z目标分子与配体形成复合物而吸附在层析柱上z起始缓冲液的选择：配体-目标分子作用类型疏水键，提高离子强度，不要采用低温操作；离子键，降低离子强度z流速：低压亲和层析，流速50cm/h；高效液相亲和层析，流速50125cm/h。若结合力弱，应降低流速z加样量：不超过亲和吸附剂的吸附容量48.洗去杂蛋白z5倍床体积的起始缓冲液洗去未吸附物质，直至紫外纪录曲线回到基线z亲和柱上存在较多的非特异性吸附，而目标分子结合牢固，可选用介于起始缓冲液和洗脱缓冲液之间的条件洗杂蛋白z例：起始缓冲液0.05mol/L磷酸缓冲液洗脱缓冲液含1mol/LNaCl的磷酸缓冲液可用含0.51mol/LNaCl的磷酸缓冲液洗去杂蛋白49.洗脱z专一性洗脱和非专一性洗脱50.非专一性洗脱z改变缓冲液的离子强度配体与目标分子间如果是离子作用：升高离子强度疏水作用：降低离子强度离子强度变化方式：阶段式、梯度式z改变缓冲液的pH值改变表面带电基团的电性和电量，从而破坏离子键阶段式为主51.z改变缓冲液的极性配体和目标分子依靠较强的疏水作用结合时，可以往洗脱液中添加一定比例的有机溶剂z使用洗涤剂极端疏水性蛋白质，如：膜蛋白最好使用在280nm附近无吸收的非离子型洗涤剂，如NP-40,Lubrol52.z使用促溶盐（chaotropicsalt）促溶盐能破坏水的结构，降低配体-蛋白质间疏水作用的强度亲和层析洗脱时常用的促溶剂有13mol/L硫氰化钾、13mol/L碘化钾、4mol/LMgCl2z使用蛋白质变性剂8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍 蛋白质沉淀（盐析）效应增加阴离子：PO43,SO42,CH3COO,Cl,Br,NO3,ClO4,I,SCN阳离子：NH4+,Rb+,K+,Na+,Cs+,Li+,Mg2+,Ca2+,Ba2+蛋白质促溶（盐溶）效应增加 53.StepelutionGradientelution54.z专一洗脱(亲和洗脱)使用配体，如：用不同的核苷酸将脱氨酶从染料柱上洗脱使用能与配体结合的分子，如：用游离糖将糖蛋白从凝集素柱上洗脱优点：洗脱条件温和，目标分子不会变性缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后需要进一步分离55.CompetingbindingsubstanceinsolutionElutionofglycoproteinsfromConASepharosebya-D-methylmannosideSpecificeluents+CompetingligandinsolutionElutionofenzymesfromBlueSepharosebyfreeNADH+56.洗脱方式洗脱方式总结:.pH变化（破坏静电引力）.I变化（减弱静电引力、范德华力）.亲和洗脱L的类似物L，S的类似物S*采用酶促反应的多元专一性洗脱.表面活性剂减少疏水作用、范德华力种类常有：曲通X1001%（V/V）、乙二醇等57.解离试剂主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等.降低温度t较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力.电泳解吸+在柱两端连上电极进行电泳四、脱盐-五、再生58.再生和保存再生和保存z再生的目的是除去所有仍然结合在柱上的物质几个床体积的起始缓冲液再平衡采用高浓度盐溶液，如2mol/LKCl根据配体的稳定性升高和降低pH值、加入洗涤剂、使用尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶z保存时应加抑菌剂，如0.02%W/V叠氮钠59.第六第六节其它亲和色谱简介一、共价色谱利用形成和破坏共价键能力的差异分离其共价键常为二硫键S-S主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽基本层析过程60.61.二、金属螯合色二、金属螯合色谱原理HisCysTrp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。固定方法：将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶联成配基，再用金属离子处理。如洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA原原理理62.原理z蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物63.64.65.金属螯合金属螯合亲和和层析材料析材料z载体Sepharose4B或6B，亲水树脂z配体亚氨基二乙酸（IDA）：3个配位基团三（羧甲基）乙二胺（TED）：5个配位基团z金属离子Cu2+Ni2+Zn2+Co2+Ca2+,Mg2+66.金属螯合金属螯合亲和和层析析实例例z纯化带六聚组氨酸（6xHis）末端的基因重组酶NAD激酶z样品准备重组NAD激酶表达菌离心，分散于起始缓冲液，超声破碎细胞，离心提取上清得粗酶液z层析材料Ni-chelating，以亚氨基二乙酸作为配体的环氧乙烷活化琼脂糖凝胶，螯合离子为镍离子67.z装柱10Vt50mmol/LEDTA-0.5mol/LNaCl除去杂质，5Vt蒸馏水清洗，0.6Vt0.1mol/LNiSO4固定金属离子z起始缓冲液20mmol/LKPB,pH7.5、0.1mmol/LNAD、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mol/LNaCl、10mmol/L咪唑z加样、吸附、洗去杂质z洗脱液10mmol/L0.5mol/L咪唑梯度缓冲液解吸z清洗和再生强螯合剂0.05mol/LEDTA,0.5mol/LNaCl再生亲和柱，5Vt蒸馏水洗涤，储存于20%乙醇68.蛋白质(mg)NAD激酶活性(U)回收率(%)比活(U/mg)纯化倍数()细胞提取液880111000.01251Ni-亲和层析4.66.353.681.367910769.四、有机染料亲和色谱有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。70.Dye-stuffsCibacronBlue3G-AmimicsNADH71.染料配体亲和层析z以仿生染料，主要是三嗪染料作为配体的亲和层析z常用的染料有CibacronblueF3GA（多芳香环的磺化物）和ProcionRedHE3B，多以Sepharose作为载体，前者称蓝色Sepharose，后者称红色Sepharosez具有一定的阳离子交换作用，应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附作用72.原理原理z蓝色染料CibacronblueF3GA在结构上与NAD+和NADP+很相似，用于纯化NAD+、NADP+依赖性酶，如各种激酶、磷酸酶、脱氢酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等z红色染料ProcionRedHE3B用于纯化NADP+依赖性酶，如某些脱氢酶，以及其他非相关蛋白质，如干扰素、抑制蛋白、羧肽酶G、血纤蛋白溶酶原等，结合不仅依赖于特定基团，还依赖于离子键或疏水相互作用73.材料材料z制备：偶联到6%交联琼脂糖（SepharoseCL-6B）z商品化染料亲和吸附剂RedSepharoseCL-6B74.染料配体染料配体亲和和层析析实例例z从Candidautilis中分离NADP+依赖型酶吸附缓冲液：中性pH缓冲液洗脱缓冲液：专一性洗脱：含NAD+或NADP+的缓冲液非专一性洗脱：增加离子强度至2MNaCl或1MKCl75.A：非吸附蛋白，B：6-磷酸葡萄糖脱氢酶，C：谷氨酸脱氢酶，D：谷胱甘肽还原酶，E：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶76.五五凝集素凝集素亲和和层析析z凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合z不同的凝集素结合不同的糖分子z用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等77.凝集素分子量亚基数目特异性洗脱糖类所需离子伴刀豆球蛋白A550002/4-D-甘露糖-D-葡萄糖-甲基甘露糖-甲基葡萄糖Ca2+Mn2+扁豆凝集素490002-D-甘露糖-D-葡萄糖-甲基甘露糖-甲基葡萄糖Ca2+Mn2+豌豆凝集素490004()-D-甘露糖-甲基甘露糖蓖麻凝集素1200004-D-半乳糖乳糖，半乳糖蓖麻凝集素600002-D-N-乙酰半乳糖胺-D-N-乙酰半乳糖胺麦芽凝集素360002N-乙酰葡糖胺N-乙酰葡糖胺Ca2+Mn2+Zn2+大豆凝集素1100004-D-N-乙酰半乳糖胺-D-N-乙酰半乳糖胺半乳糖植物血球凝集素1280004-D-N-乙酰半乳糖胺-D-N-乙酰半乳糖胺Ca2+Mn2+78.凝集素亲和吸附剂的合成z据待分离物质所带糖基选择适当的凝集素作为配体z选择载体一般选用商品化的活化载体，如CNBr-活化的Sepharose-4B，CDI-活化的Sepharose等z偶联z封闭活性位点79.凝集素凝集素亲和和层析析实例例z人细胞表面抗原的纯化吸附剂：ConASepharose-4BConA：伴刀豆球蛋白A，是从刀豆中分离出的四聚体金属蛋白，与-D-甘露糖，-D-葡萄糖结合吸附缓冲液：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，1mMMnCl2，1mMCaCl2，pH7.4洗脱缓冲液：0.10.5M甲基-D-葡萄糖或甲基-D-甘露糖80.z填充层析柱，用10Vt的吸附缓冲液清洗并平衡柱子z以15cm/h的流速加样z用5-10Vt的吸附缓冲液洗去杂蛋白，直至洗脱液中不含任何杂质分子（用A280监测）z用5Vt的洗脱缓冲液进行洗脱操作步骤81.第七节应用（p161-166)抗体和抗原的纯化酶的的纯化化糖蛋白和脂蛋白的纯化其它蛋白质细胞的纯化82.分离分离酶蛋白蛋白z利用酶的底物、底物类似物、产物、辅助因子、激活剂、抑制剂等作为配体，采用亲和层析可以分离多种酶z层析材料大多制备商品化吸附剂（NAD、GSH等作为配体）83.z分离胆固醇氧化酶（cholesteroloxidase）10g预活化SephadexLH20浸入100mL饱和胆固醇乙醇溶液充分溶胀装入2.610cm层析柱35VtpH7.5,5mM磷酸钾缓冲液平衡，使胆固醇完全结晶加入15mL待分离样品15Vt缓冲液洗去杂质含不同浓度TritonX-100的缓冲液洗脱不同表面活性剂浓度下胆固醇氧化酶的亲和层析分离图谱84.z分离谷胱甘肽转硫酶（GlutathionS-transferases，GSTs）GST是机体内一组具有解毒作用的同工酶家族，由两个亚基组成的二聚体z亲和层析介质Sepharose4B-GSH的制备Sepharose4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化，将GSH偶联到载体上z样品的准备4g兔肝剪碎，加入约10倍重量的BufferA，用组织捣碎机匀浆，低速离心10min，弃沉淀，上清再次离心（4C，100000g，40min），弃沉淀，滤纸过滤上清液85.z结合缓冲液（BufferA）：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mM二硫苏糖醇（DTT），1mMEDTA，0.2MNaClz洗脱缓冲液（BufferB）：0.025M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mMGSH，2mMDTT上样平衡洗脱兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱86.思考思考1、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。2、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入“手臂”？3、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围。87.课后后报告告实例分析新型亲和层析的应用价值和发展趋势88.5/27/202489.