酶的提取与分离纯化ppt课件.ppt
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1、酶的提取与分离纯化(制作人:王众 黄文辉 王晨)1.要点:细胞破碎:提取:沉淀分离:离心分离:过滤与膜分离:层析分离:电泳分离:萃取分离:结晶 10:浓缩与干燥2.1 细胞破碎细胞破碎是通过各种过程使细胞外层结构破坏的技术过程。细胞破碎的方法 机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法 3.机械破碎法l1 捣碎法定义 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。使用范围 动物内脏 植物叶芽 细菌l2 研磨法利用研钵,石磨,细菌磨,球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。必要时加入石英砂等助磨剂。使用范围 植物和微生物组织细胞的破碎l 3 匀浆法 利用匀浆器产生的剪切力将
2、组织细胞破碎的方法。使用范围 易于分散,颗粒较小,比较柔软的组织细胞 也可以对捣碎法和研磨法产生的颗粒进行进一步研磨4.物理破碎法l定义:通过温度,压力,声波等物理因素的作用是组织细胞破碎的方法。多用于微生物细胞的破碎1 温度差破碎法利用温度的突然变化热胀冷缩的作用使细胞破碎的方法称为温度差破碎法用于脆弱,易于破碎的细胞的革兰氏阴性菌,酶提取时 温度不能过高,难于用于工业生产 2 压力差破变化碎法利用压力的突然变化,使细胞破碎的方法称为压力破碎法。常用的有高压冲击法,突然降压法 及渗透压变化法渗透压变化法是渗透压突然变化引起的细胞破碎的方法,此法特别适用于膜结合蛋白酶细胞间质酶等的提取,但对革
3、兰氏阳性菌不适合,主要是细胞壁由肽聚糖组成,能承受渗透压的突然变化。3 超声波破碎法利用超声波发生器所发生的声波或者超声波的作用,使细胞膜产生空穴(cavitation)而使细胞破碎的方法。简便,快捷,效果好,特别适合微生物细胞的破碎,对数生长期的细胞进行破碎5.化学破碎法 定义:通过各种学试剂对细胞膜的作用,使细胞破碎的方法。常用的化学试剂:甲苯,丙酮,丁醇,氯仿等有机溶剂 表面活性剂 :特里顿(Triton),吐温(Tween)(非离子型)原理:有机溶剂使细胞膜的磷脂结构破坏,改变细胞膜的通透性,低温下进行。表面活性剂与磷脂及至蛋白相互作用,破坏细胞结构。表面活性剂有离子型和非离子型两种。
4、离子型对细胞膜的破坏性 效果较好,但会破坏酶的空间结构,故采用非离子型的。6.酶促破碎法定义:通过细胞自身的酶系或者外加酶制剂 的催化作用,使细胞的外层结构遭到破坏,而达到细胞破碎的方法。自溶法:自身酶系,取决于温度,离子强度。外加酶:革兰氏阳性菌溶菌酶破坏,糖苷键酵母菌葡聚糖酶 水解 -1,3-葡聚糖霉菌几丁质酶植物细胞纤维素酶,半纤维素 酶和果胶酶7.提取定义:在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程,也成为酶的提取。酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液0.020.5mol的盐溶液用于提取在的低浓度盐溶液中溶解度大的酶酸溶液PH26的
5、水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂可能与水互溶的有机溶剂用于那些与脂质结合牢固或含有较多非极性集团的酶8.提取方法1盐溶液提取:大多数蛋白酶都溶于水(P酶),而且在低浓度盐溶液条件下,酶的溶解度随着盐浓度的升高而增大的现象称为盐溶。当盐浓度达到一定的界限后,酶的溶解度随着浓度的提高而降低的现象称为盐析。核酸类酶(R酶)的提取,一般在细胞破碎后,用0.14mol/L的氯化钠溶液提取,得到核糖核蛋白提取液,在进一步与蛋白质等杂质分离酶酸溶液的提取:有些酶在酸性溶液的溶解度大,且稳定性好,宜用酸溶液提取,不能
6、太低,以免使酶失活。胰蛋白酶可用()的硫酸溶液提取碱溶液提取:适用于在碱溶液溶解度大且稳定性好的酶,例如天冬氨酸酰胺酶在的碱液提取。注意加碱液时要一边搅拌一边搅拌加入,以免局部过碱,造成酶失活。有机溶剂提取与脂质牢固结合且含有较多非极性集团的酶,可采用与水混溶的乙醇,丙酮,丁酮等有机溶剂提取,例如琥珀酸脱氢酶,胆碱脂酶,细胞色素氧化酶采用丁醇提取。9.影响提取的主要因素温度温度对酶的提取效果影响明显,适当提高温度,可以增加酶的溶解度和分子扩散速度,但温度过高会引起酶的变性失活。采用有机溶剂时,温度控制在低温条件下。室温下提取的有酵母醇脱氢酶,细菌碱性磷酸酶,胃蛋白酶。溶液的对酶的溶解度和稳定性
7、有显著影响,不同的酶会带不同的电荷及其带的电荷量不同,酶在等电点的溶解度最低,故提高溶解度应该避开等电点,但不能过高过低。提取液的体积增加提取液的用量,可以提高酶的提取率。过量的提取液会使酶浓度降低,对分离纯化不利。所以提取液总量一般为原料体积的体积,最好分几次提取。在酶的提取过程中,体积小,颗粒的比表面积大,扩散面积大,有利于提高扩散速度,适当的搅拌和适当的延长时间,可使酶更好的溶解出来。注意为了保护酶的稳定性,可加某些保护剂,如与酶作用的底物,辅酶,某些抗氧化剂。10.沉淀分离定义:沉淀分离就是改变某些条件或者加入某些物质,使酶的溶解度降低,而从溶液中沉淀析出,与其他物质分离的技术过程。沉
8、淀分离方法沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同的蛋白质在不同浓度的盐溶液中溶解度不同的特性,通过在酶液中定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,使酶和杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点的溶解度最低的特点和不同的物质具有不同的等电点的特点,通过调节溶液的,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶和杂质分离有机溶剂沉淀法 利用酶在有机溶剂具有不同溶剂的特点,通过加入一定量的有机溶剂,使酶和杂 质分离 11.盐析沉淀法定义:盐析沉淀法简称盐析,是利用不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解度不同的特性,通过在酶液中加入一定浓度的中性盐,使目标酶或杂质从酶液中析出,从而达到使酶与杂质分开的方法。原理:盐离子
9、会改变蛋白质表面的电荷,同时改变了水的活度,使分子表面的水化膜发生改变。酶的溶解度和离子强度有确定的定量关系 (S/S0)=-Ks I 式中,s为蛋白质或酶在离子强度为I时的溶解度(g/L);S0为酶或蛋白质在离子强度为0时(即在纯溶剂)的溶解度(g/L);Ks为盐析系数;I为离子强度。上式子中 S=S0 -Ks I=-Ks I 为s0,主要取决于酶或蛋白质的性质,也和温度和PH有关,当温度和PH一定时,为一常数。Ks为盐析系数,主要取决于盐的性质,Ks与离子价数成正比,与离子半径和溶液的界电常数成反比,与酶或蛋白质的结构液有关。12.盐析沉淀法离子强度I的计算 I=mi为离子浓度(mol/L
10、);为离子价数miZi213.盐析沉淀法1 在一定的温度和PH条件下(为常数),通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析;而在一定盐浓度和离子强度的条件下(KsI为常数),通过改变温度和PH,使不同的酶和蛋白质分离的方法,称为分段盐析。2 常用的中性盐有硫酸铵,硫酸钠,硫酸钾,硫酸镁,氯化钠和磷酸钠,硫酸铵最常用,因为硫酸铵在水里的溶解度大且温度系数小,不影响酶的活性,分离效果好,而且价廉易得。但用硫酸铵,缓冲能力较差,而且铵离子的浓度会干扰蛋白质的测定,所以有时用其他中性盐盐析。在硫酸铵盐析时,常用饱和度表示浓度定义:溶液中加入饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比。相关数
11、据可以查文献。14.等电点沉淀法原理:利用两性电解质在等电点时溶解度最低和不同的电解质具有不同的等电点的特性,通过调节溶液的PH,使酶或蛋白质沉淀析出,从而使酶和蛋白质分离的方法。由于在等电点时,两性电解质表面的水化膜依然存在,故实际上酶等大分子蛋白质仍有一定的溶解性,从而使沉淀不完全。在实际中,此法经常与其他方法一起使用,如等电点经常与盐析沉淀,有机溶剂沉淀,和复合沉淀一起使用。单独使用时,主要是从粗酶中除去某些等电点相差较大的蛋白质。加酸碱时,一边搅拌一边慢慢加进,防止局部过酸过碱一起蛋白质变性。15.有机溶剂沉淀法l定义:利用酶和杂质在有机溶剂的溶解度不同的特性,通过加入某种特定的一定量
12、的有机溶剂,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶和蛋白质分离的方法。l原理:有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。既增大了溶质的静电引力,又破坏了溶质周围分子的水膜。l常用的有机溶剂:乙醇,丙酮,异丙醇,甲醇l影响因素:用量和PH(最好等电点附近)l优缺点:比盐析的沉淀易于离心或过滤;不含无机盐,分辨率高,但易引起酶变性失活,所以必须在低温下操作,沉淀析出后尽快分离,尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。16.复合沉淀法定义:在酶液中加入某些物质,使它与酶形成复合物沉淀下来,从而使酶和杂质分离的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂:单宁,聚乙二醇,聚丙烯酸例:菠萝蛋白酶与单宁复合可以制成药片,用于治疗咽喉炎
13、复合物有的可以直接中使用,有的用适当的方法,使酶从复合物中析出进一步纯化。17.选择性变性沉淀法定义:选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀,而不影响所需酶的方法。方法:热处理,改变PH或加入某些金属离子应用此法必须对与分离的酶以及酶液中的杂蛋白的种类含量及其物理和化学性质有较全面的了解。18.4 离心分离离心分离离心机的选择离心方法的选用离心条件的确定19.离心机的选择1 常速离心机 常速离心机又称低速离心机,最大转速在8000r/min以内,相对离心力(RCF)在1*104g以下,主要用于细胞,细胞碎片和培养基残渣的分离,也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。2 高速离心机 最大转速在(12.5)*10
14、4r/min,相对离心力达到1*1041*105g,在酶的分离中主要用于沉淀,细胞碎片和细胞器等的分离。由于转速过高,引起温度过高引起酶失活,故有的安有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。3超速离心机 转速能达到(2.512)*104r/min,相对离心力能达到5*105甚至更高。主要用于DNA,RNA,蛋白质等生物大分子以及细胞,病毒等的分离纯化,样品纯度系数的检测,以及沉降系数和相对分子质量的测定。超速离心机可分为制备用超速离心机,分析用超速离心机和分析制备两用超速离心机。20.离心方法的选用 1 差速离心 采用不同的离心速度和时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。主要用于大小和密度相差较大
15、的颗粒,操作简单方便,但分离效果较差,沉淀物中含有较多杂质,沉淀在离心管的底部受到挤压。2 密度梯度离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中,使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。3等密度梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围在介质密度范围之内,在离心力的作用下,不同浮力密度的颗粒或向下沉降,或向上漂浮,只要时间足够长,就能移动到与它们各自密度相等的位置(等密度点),形成区带,这种方法叫做等密度离心或称平衡等密度离心。21.密度梯度离心 梯度介质的选取 1 有足够大的溶解度,形成所需的密度梯度 2 不会与样品中的组分发生反应,也不会引起组分的凝 集,变性和失活 3 常用的密度梯度
16、介质 蔗糖 甘油 蔗糖密度梯度系统应用最多 密度梯度的制备 一般采用密度梯度混合器进行制备。离心 适当地增加离心速度缩短离心时间,减少扩少散导致的区 带扩宽现象。22.等密度梯度离心密度梯度离心,由于受到密度介质的影响,故分离的颗粒并未达到其等密度位置。而等密度分离欲要求欲分离的颗粒处于密度梯度的等密度点。为此两种密度梯度离心所使用的密度介质和密度梯度范围应有所不同。常用的离心介质 氯化銫 硫酸銫 溴化銫 三碘苯的衍生物 过程 1 密度介质和样品结合 2 离心 注意:銫盐对铝合金转子具有极强的腐蚀作用,防止銫盐溶液溅到转子上,用完后将转子仔细清洗和干燥。最好用钛合金的。23.离心条件的确定离心
17、条件离心力离心时间温度和PH24.离心力低速离心一般用转速,即转子每分钟的转数表示,如5000r/min.而在高速特别是超速离心时,往往以相对离心力(RCF)表示,如5000g.相对离心力是颗粒所受到的离心力与地心的引力的比值。式中,RCF为相对离心力(g);FC为离心力;F g为地心引力;n为转子 每分钟的转数(r/min);r为旋转半径(cm).一般离心力的数值是平均数值,即在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。25.离心时间对于低速和高速离心机和差速离心来说,离心时间是指颗粒从离心管样品液的液面完全沉降到离心官底的时间,称为沉降时间或澄清时间。对于密度梯度离心而言,离心时间是指形成界限分明的
18、区带时间,称为区带形成时间。等密度梯度离心,是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间,称为平衡时间。其中最常用的是沉降时间。26.沉降时间 沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。t表示沉降时间(s);s表示颗粒的沉降系数;w表示转子的角速度(r ad/s);r1,,r2分别表示旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离(cm)上式子做如下变换 k称为转子因子27.温度和PH离心温度一般控制在4左右,对于某些耐热性较好的酶,也可以在室温下进行离心分离。但在超速离心和高速离心时,由于转子高速旋转会发热而引起温度升高,必须采用冷冻装置,使温度维持在一定范围内。离心介质的PH必须处于酶稳定的PH范围内,必要时
19、可采用缓冲溶液,过高过低可能引起酶的变性失活,还可能引起转子和离心机其他部件的腐蚀,应当加以注意。28.5 过滤和膜分离过滤是借助过滤介质将不同大小,不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质不同分为膜过滤和非膜过滤两大类。根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同,过滤可分为粗滤,微滤,超滤和反渗透29.过滤的分类及其特性 类别 截留颗粒的大小 截留的主要物质 过滤介质 粗滤 2m 酵母,霉菌,动植物 滤纸 滤布 纤维多孔陶瓷 细胞 固形物 烧结金属微滤 0.22m 细菌 灰尘等 微滤膜 微孔陶瓷等超滤 200.2m 病毒 生物大分子等 超滤膜反渗透 20 生物小分子,盐,离子 反渗透膜30.非膜过滤定
20、义:采用高分子膜以外的材料,如滤纸,滤布,多孔陶瓷,纤维,烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤,包括粗滤和部分微滤 粗滤:借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2m的颗粒,使固形物和液体分离的技术。粗滤应用范围:酵母 霉菌 动植物细胞 培养基残渣 大 颗粒固形物粗滤介质 :滤纸 滤布 纤维 多孔陶瓷 烧结金属助滤剂 :硅藻土 活性炭 纸粕推动力 :常压过滤 加压过滤 减压过滤31.粗滤1常压过滤 以液位差为推动力的过滤方法 过滤设备简单,操作易行方便,但过滤速度慢分离效果差2加压过滤 以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力的过滤方法。设备简单,过滤较快,过滤效果好3减压过滤 又称真空过滤或抽
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