补充2酶催化活性的测定方法ppt课件.ppt
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1、 补 充充 2 2酶催化活性的催化活性的测定方法定方法2024/5/26 周日1.目目 的的掌握定掌握定时法和法和连续监测法法测定定酶活性的原理及方法活性的原理及方法2.一、一、测定定酶促反促反应速度的两速度的两类方法方法(一)(一)酶促反促反应速度的表示方法速度的表示方法 单位位时间的底物的消耗量(的底物的消耗量(-dS/min-dS/min)单位位时间的的产物的生成量(物的生成量(dP/mindP/min)来表示)来表示(二)(二)测定方法分定方法分类 定定时法法 在一定在一定时间内通内通过测定定总变化量再化量再计算出速度算出速度.连续监测法法 直接用来直接用来测定速度定速度3.(一)定(
2、一)定时法法1.1.概念概念 在足量的底物系在足量的底物系统中,加入一定量的中,加入一定量的酶试剂,反,反应一一定定时间后,加入后,加入终止止剂终止反止反应,然后,然后测定底物的消耗量或定底物的消耗量或产物的生成量物的生成量2.2.酶活性的活性的结果果计算算 假假设某一某一样品的品的酶活性活性为X X(U/LU/L),取),取样品量品量VsVs毫升与底物毫升与底物缓冲液冲液VrVr毫升孵育,毫升孵育,经过t t分分钟反反应,加入,加入终止液止液 Ve(ml)Ve(ml),检测到到产物物净吸光度增加吸光度增加为A A,该产物的摩物的摩尔消光系数消光系数为 (终点法的摩点法的摩尔消光系数一般可通消
3、光系数一般可通过带标准求得)比色皿光径准求得)比色皿光径为b(cm)b(cm)4.若把若把A/tA/t以以A/minA/min表示,表示,则此定此定时法法测定定酶活性的活性的计算公式与算公式与连续监测法相同法相同5.3.3.定定时法与法与终点法和两点法的区点法和两点法的区别定定时法法 是是经过一定一定时间(固定的(固定的时间)反)反应后后终止反止反应 终点法点法 指反指反应基本达到平衡,信号基本达到平衡,信号变化很小,但可以不需化很小,但可以不需要要终止反止反应两点法两点法 监测反反应过程中的两个点,即某一段程中的两个点,即某一段时间内的底物内的底物或或产物的物的变化化6.(二)(二)连续监测
4、法法1.1.原理原理 连续监测法是将法是将酶与底物在特定条件(与底物在特定条件(缓冲液、温度冲液、温度等)下孵育,每隔一定等)下孵育,每隔一定时间(2-60s2-60s)连续测定定酶促反促反应过程中程中某一底物或某一底物或产物的特征信号(如物的特征信号(如NADHNADH在在340nm340nm的吸光度)的的吸光度)的变化,化,从而从而计算出每分算出每分钟的信号的信号变化速率化速率2.2.酶促反促反应动力学曲力学曲线 一个典型的一个典型的酶促反促反应过程一般包括延滞程一般包括延滞期、期、线性期和非性期和非线性期性期7.1.1.延滞期延滞期 对单一一酶促反促反应而言,是指而言,是指酶促反促反应从
5、开始到达最大反从开始到达最大反应速度所需要的速度所需要的间,包括,包括酶催化位点的暴露、底物解离后与催化位点的暴露、底物解离后与酶结合合位点的位点的结合、合、酶与与辅酶的的结合、合、酶的激活等等的激活等等 对于于酶偶偶联反反应而言,延滞期而言,延滞期还包括中包括中间产物堆物堆积到一定到一定程后,程后,导致指示反致指示反应速度增加,直到与待速度增加,直到与待测酶酶促反促反应速度达到速度达到平衡所需的平衡所需的时间。一般来。一般来说,辅助助酶越多,延滞期越越多,延滞期越长2.2.线性期性期 是指是指酶促反促反应速度保持恒定的速度保持恒定的时期,不受底物期,不受底物浓度的影响。度的影响。此期底物此期
6、底物虽被不断消耗但被不断消耗但还不足以明不足以明显改改变酶促反促反应的速度,即的速度,即以初速度以初速度进行行3.3.非非线性期性期 随着反随着反应的的进行,底物消耗越来越明行,底物消耗越来越明显,反,反应速度明速度明显下降下降而而进入非入非线性期。性期。酶浓度越高在度越高在选定条件下定条件下线性期就越短。其他性期就越短。其他造成造成进入非入非线性期的原因有可逆反性期的原因有可逆反应增增强、产物抑制增加、物抑制增加、酶变性失活增加、性失活增加、酶聚合或解离增加等等聚合或解离增加等等8.(二)(二)连续监测法法酶活性的活性的结果果计算算 假假设某一某一样品的品的酶活性活性为x x(U/LU/L)
7、,取),取样品量品量V Vs s与底物与底物缓冲液冲液V Vr r孵育,延滞期孵育,延滞期为t t0 0分分钟,测定定间隔隔时间为t t1 1分分钟,读数次数数次数为n n,每每间隔隔时间吸光度吸光度变化平均化平均值为A A,该产物的摩物的摩尔消光系数消光系数为比比色皿光径色皿光径为b b(cmcm)。反)。反应速度分速度分别用用产物的生成速度和物的生成速度和样品中品中酶的催化能力来表示的催化能力来表示 9.二、二、酶活性活性测定方法原理定方法原理(一)直接法(一)直接法 根据待根据待测酶的的酶促反促反应底物或底物或产物有特征性的理化性物有特征性的理化性质,然后通然后通过特殊的特殊的仪器直接器
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