基于S-亚硝基化解析一氧化...环血酸-谷胱甘肽循环的影响_伊丽达娜·迪力夏提.pdf

食品与发酵工业 （）：引用格式：伊丽达娜迪力夏提，魏佳，王曼，等 基于 亚硝基化解析一氧化氮对哈密瓜采后抗环血酸谷胱甘肽循环的影响 食品与发酵工业，（）：，（）：基于 亚硝基化解析一氧化氮对哈密瓜采后抗环血酸谷胱甘肽循环的影响伊丽达娜迪力夏提，魏佳，王曼，袁宇尧，张政，吴斌（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐，）（新疆农业科学院 农产品贮藏加工研究所，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐，）（新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐，）摘 要 为了探究一氧化氮（）对哈密瓜采后贮藏期的抗氧化作用，该研究以“西州蜜”为试材，采用外源 精准熏蒸方法，分析测定哈密瓜生理指标、亚硝基化水平和抗氧化指标的变化，从 亚硝基化水平的角度探讨 对哈密瓜采后抗坏血酸谷胱甘肽循环（，）的影响。结果表明，熏蒸能较好地维持哈密瓜贮藏品质，降低果实、丙二醛（，）含量，显著提高果实内源 和亚硝基硫醇（，）含量，抑制 亚硝基谷胱甘肽还原酶（，）活性升高。熏蒸可以维持较高的抗坏血酸（，）和脱氢抗坏血酸（，）的比值（）、还原型谷胱甘肽（，）和氧化型谷胱甘肽（，）的比值（）。在整个贮藏期，处理组抗坏血酸过氧化物酶（，）、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶活性高于对照组。熏蒸通过提高哈密瓜果实的 亚硝基化水平，激活了 循环关键酶的活性，提高了清除 的效率，缓解了脂质过氧化，从而维持了哈密瓜采后贮藏品质。关键词 一氧化氮；哈密瓜；活性氧；亚硝基化；抗坏血酸谷胱甘肽循环第一作者：硕士研究生（吴斌研究员为通信作者，：）基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（）；新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目（）收稿日期：，改回日期：哈密瓜（），因其营养丰富、口感和风味俱佳，深受消费者青睐。但是随着贮藏时间的延长，哈密瓜果实活性氧（，）代谢极易失衡，产生大量的，加速果实细胞膜脂过氧化进程，导致果实贮藏品质下降、腐烂变质等，缩短了哈密瓜的贮运期和货架期。采后果实通过酶促和非酶促的抗氧化系统来清除过量的 并维持果实品质。抗坏血酸谷胱甘肽循环（，）是一种抗氧化体系，可以清除 并缓解 诱导的毒害作用，在植物抗氧化体系中具有维持氧化还原稳态的作用。还原型谷胱甘肽（，）、抗坏血酸（，）都是酶活性的底物，在 循环的一系列反应中控制的水平。此循环系统如图 所示。作为一种多功能的信号分子，在许多植物生理调控过程中扮演了重要的角色。可以延缓果实成熟衰老、维持果蔬品质和延长货架期，这可能与 参与调控抗氧化相关酶基因表达或酶蛋白亚硝基化（）修饰有关。蛋白质 亚硝基化修饰是内源 发挥广泛生物活性的主要分子机制之一。该修饰形成的 亚硝基硫醇（，）可调控蛋白质的结构、稳定性、细胞定位、蛋白质蛋白质相互作用等。蛋白组学研究表明，循环中、单脱氢抗坏血 酸 还 原 酶（，）和谷胱甘肽还原酶（，）是 介导的翻译后修饰的潜在靶蛋白。拟南芥中的 被确定为 亚硝基化的靶蛋白，而在水稻中 被确定为 亚硝化的靶蛋白。在柑橘植物、水稻和拟南芥中 被确定为 亚硝化靶蛋白。因此，可以通过蛋白质 亚硝基化影响 循环系统中相关酶的活性，进而影响该循环的清除能力。关于外源 诱导的 亚硝基化对哈密瓜 循环影响的研究鲜有报道。因此，本文采用外源施加 的方法，探讨外源 通过缓解由衰老引起的氧化胁迫、保持哈密瓜品质的效应及其作用机制。通过对生理响应、亚硝基化水平、循环的研究，分析哈密瓜采后贮藏过程中 亚硝基化与抗氧化体系的内在联系。研究报告 年第 卷第 期（总第 期）图 植物中 循环体系 注：首先，以 为电子供体将 还原为，。可通过 还原 中再生，。由于 很不稳定，在歧化反应中生成 和。以 个 分子为代价将 还原为，。最后，氧化后的 再次被，以 为代价还原。（，抗坏血酸）；（，单脱氢抗坏血酸）；（，脱氢抗坏血酸）；（，还原型谷胱甘肽）；（，氧化型谷胱甘肽）；（，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）；（，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）；（，抗坏血酸过氧化物酶）；（，单脱氢抗坏血酸还原酶）；（，脱氢抗坏血酸还原酶）；（，谷胱甘肽还原酶）材料与方法 材料与试剂哈密瓜品种为“西州蜜 号”（），采摘自吐鲁番高昌区三堡乡种植园，立即运回新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所冷库（）预冷 。挑选出成熟度一致、大小均匀、无病虫害和机械伤的果实，随机分组进行后续实验。气体（纯度），乌鲁木齐鑫天意标准气体有限公司；还原型辅酶、亚硝基谷胱甘肽，上海麦克林生化科技有限公司；抗坏血酸，天津市福晨化学试剂厂；盐酸萘乙二胺，天津市化学试剂研究所有限公司；还原性谷胱甘肽、牛血清蛋白，瑞禧生物国产 进口有限公司。仪器与设备熏蒸罐，课题组自主设计；型紫外可见分光光度计，上海普析通公司；型高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；型 冰箱，青岛海尔股份有限公司；型果实硬度计，山东莱恩德智能科技有限公司。实验方法 样品处理挑选大小基本一致、无机械损伤及病虫害的果实，随机分成 组进行试验。种处理包括：（）空气熏蒸作为对照处理（）；（）熏蒸处理。熏蒸处理：课题组前期研究 熏蒸哈密瓜适宜浓度和时间为 、。哈密瓜置于熏蒸罐（）中，先抽真空，再注入氮气使罐内压力等于大气压力，然后使用气体进样针注入 标准气体，立即拔出注射器针口，同时打开风扇，使 气体在密封箱中均匀分布。处理：熏蒸罐中放置哈密瓜但不充入 气体，放置 。处理后的哈密瓜置于（），相对湿度为（）条件下进行贮藏。取样时间分短期贮藏组和长期贮藏组，分别在、和、各取 个哈密瓜测定硬度、腐烂率和失重率。随后将哈密瓜纵向中线切开，取距果皮 处果肉，用液氮处理后迅速粉碎，装袋置于 冰箱内，用于后续各项指标的测定。测定指标与方法 硬度的测定参照田全明等的方法。将哈密瓜纵向中线切开，围绕果实赤道部位等间距的 个位置，用果实硬度计测定硬度，取平均值。单位：牛（）。失重率、腐烂率的测定果实的失重率、腐烂率根据田全明等的方法计算，计算方法如公式（）、公式（）所示：失重率 贮藏前质量 贮藏后质量贮藏前质量（）腐烂率 腐烂果实数总果实数（）内源 含量的测定内源 含量的测定参照 等的方法并稍作修改。取 冷冻样品，加入 冰醋酸缓冲液 ，含 （体积分数）乙酸锌，在 、条件下离心 制备提取液。将 的上清液和 试剂混匀，在室温下孵育，测定 下的吸光值。每个样品重复测定 次。含量的测定 含量的测定参照 等的方法并食品与发酵工业 （）稍作修改。取 冷冻样品，加入 磷酸盐溶液（，含 四乙酸乙二胺和 乙二 醇 双 四 乙 酸），混 匀 后 在 、条件下离心 制得提取液。取 提取液分别与 溶液 含（体积分数）磺胺、盐酸萘乙二胺和 溶液（含磺胺、盐酸萘乙二胺和 氯化汞）混合，黑暗条件下放置 ，在 下测吸光值。根据溶液 和 的测定值之差来量化 的含量。用亚硝基谷胱甘肽（，）绘制标准曲线，根据标准曲线计算 的含量。每个样品重复测定 次。亚硝基谷胱甘肽还原酶（，）活性的测定 活性的测定参照 等的方法稍作修改。取 冷冻样品，加入 提取液 ，含 羟乙基哌嗪乙硫磺酸、（体积分数）甘油、氯化镁、四乙酸乙二胺、乙二醇双四乙酸和 （体积分数）曲拉通，在 、条件下离心 。取上清液 加入 分析液（，含 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、还 原 型 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 和 四乙酸乙二胺），加入 溶液至终浓度为 ，在 下测定吸光值，每 测定一次，测 个数值。每个样品重复测定 次。含量的测定参照曹建康等的方法。取 冷冻样品，加 三氯乙酸溶液研磨，研磨后的匀浆于、条件下离心。取 上清液，加 体积分数为 的 硫代巴比妥酸溶液，混匀后煮沸 ，冷却至室温后再进行一次离心。分别测定反应液在、处的吸光值。每个样品重复测定 次。按公式（）进行计算：含量（）（）式中：，反应混合液中丙二醛浓度，；，样品提取液浓度，；，测定时所取样品提取液体积，；，样品质量，。含量的测定参照曹建康等的方法并稍作修改。取 冷冻样品，加 三氯乙酸（体积分数为 ）溶液研磨，研磨后的匀浆于 、条件下离心。取 上清液加入 碘化钾溶液和 磷酸盐（）溶液中。在 处记录吸光值。每个样品重复测定 次。和 含量的测定参照 等的方法并稍作修改。取 冷冻样品，加入 三氯乙酸，条件下充分研磨，于 、条件下离心 ，上清液立即用于 和 的测定。（总抗坏血酸）含量的测定：向 上清液中加入 二硫苏糖醇乙醇溶液，用磷酸氢二钠氢氧化钠混合液将溶液 调至，置于室温下 ，然后加入 三氯乙酸，把 调至，在 处测其吸光值。的测定：取 上清液加入 三氯乙酸、乙醇摇匀，再依次加入 （体积分数）正磷酸乙醇、（体积分数）二苯甲酮乙醇、（体积分数）三氯化铁乙醇。将溶液置于 下反应，然后在 下测定其吸光值。含量：总抗坏血酸含量减去 含量即为 的含量。每个样品重复测定 次。和 含量的测定参照 等的方法并稍作修改。取 冷冻样品，加入 （体积分数）偏磷酸（），条件下研磨成匀浆，于 、条件下离心 ，上清液用于测定 和 的含量。（总谷胱甘肽）含量测定：粗酶液加入 反应液，其中包含 反应液 七水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸、二硫代二硝基苯甲酸、（体积分数）牛血清蛋白、反应液（乙二胺四乙酸、咪唑和 牛血清白蛋白）、反应液（体积分数为 的磷酸氢二钠，）和 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，以偏磷酸（）代替提取液作为对照，在 下测定其吸光值。含量测定：提取液加入 乙烯吡啶，下水浴 ，在 下测其吸光度。含量：总谷胱甘肽含量减去 含量即为 含量。每个样品重复测定 次。活性的测定粗酶液的提取：参照 等的方法。取研究报告 年第 卷第 期（总第 期）冷冻样品于 预冷的研钵中，加 磷酸缓冲液 ，含 、乙二胺四乙酸、（体积分数）聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通研磨，于 、条件下离心 ，上清液即为粗酶液。取 粗酶液分别加入 的磷酸缓冲液（，含 乙二胺四乙酸）、，测定 的吸光值。每个样品重复测定 次。活性的测定粗酶液的提取：参照曹建康等的方法并稍作修改。取 冷冻样品于 预冷的研钵中，加 磷酸缓冲液（，含 乙二胺四乙酸）研磨，于 、条件下离心，上清液即为粗酶液。取 粗酶液分别加入 的磷酸缓冲液（，含 乙二胺四乙酸）、，最后加入 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液以启动反应，记录 的吸光值，每隔 记录一次，连续测定 个数值。每个样品重复测定 次。活性的测定粗酶液的提取与 相同。参照 等的方法取 粗酶液，加入 磷酸缓冲液、，以不加酶液为对照，在 处测定其吸光度值。每个样品重复测定 次。活性的测定粗酶液的提取与 相同。参照 等的方法取 粗酶液，加入 磷酸缓冲液（，含 ）、抗坏血酸氧化酶，最后加入 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液启动反应，以不加酶液为对照，在 处测定其吸光值，每隔 记录一次，连续测定 个数值。每个样品重复测定 次。数据统计与分析使用 进行数据处理，使用 （）进行单因素方差分析（），（，）用于绘图。结果与分析 对果实采后品质的影响由表 可知，随着贮藏时间的延长，各组果实的硬度呈下降趋势，失重率和腐烂率都呈上升趋势，但在各个时间点处理组的硬度都明显高于对照组，失重率和腐烂率都明显小于对照组。整个贮藏过程中处理组硬度下降，对照组硬度下降 。处理组硬度下降幅度相对平缓；第 天后，对照组失重率始终高于处理组。第 天时，处理组失重率比对照组低了（）；第 天时，对照组果实开始腐烂，但是处理组果实外观无明显变化。在第 天时，对照组的腐烂率是处理组的 倍。结果表明，可以保持哈密瓜果实采后的贮藏品质，延长果实的货架期。表 熏蒸对哈密瓜硬度、失重率和腐烂率的影响 ，贮藏时间硬度失重率腐烂率 注：同一贮藏时间，不同字母表示差异显著（）对果实中 亚硝基化水平的影响由图 可知，处理组 和内源 含量都呈先上升后下降的趋势，时含量达到最大值，而对照组的、内源 含量在整个贮藏期上下波动不大，显著提高了果实 和内源 的含量（图、图）。时，处理组 含量是对照组的 倍，内源 含量是对照组的 倍。对内源 和 含量的影响很大；处理组 活性呈先下降后上升趋势，而对照组 活性在整个贮藏期上下波动不大。显著抑制了果实 活性（）（图）。处理组 的活性也是在 时达最低值，比对照组低了。结果表明，提高了哈密瓜果实的 亚硝基化水平。对果实中内源、和 含量的影响由图 可知，对照组内源 含量一直呈下降趋势，处理组 含量在 时快速上升达到最大值，到 时快速下降，呈下降趋势，显著高于对照（）。果实中 含量随着贮藏时间的延长不断上升，而处理组 含量在 前无显著差异，后显著低于对照组，在 时处理组 含量比对照组低了 （）（图食品与发酵工业 （）；各组果实 含量呈上升趋势，处理组 含量低于对照组，第 天时低于对照 （）（图）。结果表明，可以抑制贮藏期间哈密瓜 的过量积累，显著减缓了 的增加。含量；含量；活性图 熏蒸对哈密瓜、含量和 活性的影响 ，注：同一贮藏时间，表示在 水平（双侧）上差异显著（下同）含量；含量；含量图 熏蒸对哈密瓜内源、和 含量的影响 ，对果实中 循环系统底物及产物含量的影响在贮藏期，各组果实 含量总体呈逐渐下降的趋势，处理组 含量始终高于对照组（图）。第 天时，处理组 含量比对照组高了（）；各组果实 含量在贮藏期间呈先上升后下降趋势，处理组 含量明显低于对照组，处理后第 天低于对照 （）（图）；果实中 在贮藏期间呈逐渐减小的趋势，处理组始终维持了较高的 （图）。增加了果实 含量并且降低了 的含量，因此维持了较高的 比值，从而调节了哈密瓜贮藏期间的氧化还原状态。由图 可知，各组果实 含量随着贮藏时间的延长呈先上升后下降并趋于平稳，处理组 含量始终高于对照组，在 时差异显著（），时达到最大值，比同时期对照组高了；果实中 含量在贮藏期间逐渐下降，时，对照组 含量显著高于处理组（），在 时，处理组 的含量则低于对照组（图）；果实中 在贮藏期间逐渐增加，处理组始终维持了较高的（图）。结果表明，增加了果实 的含量并且降低了 的含量，因此维持了较高的 ，从而调节了哈密瓜贮藏期间的氧化还原状态。对果实中 循环系统关键酶活性的影响由图 可知，在贮藏过程中，各组果实 活性呈下降的趋势，时达到最大值，处理组 活性始终显著高于对照组（）；各组果实 活性呈先上升后下降并趋于平稳的趋势，处理组始终保持了较高的 活性，在第 天时比对照组高了 （）（图）；果实 活性先上升后下降，处理组维持了较高的 活性，在第 天时，处理组 活性比对照组高 （）（图）；各组果实 活性呈先上升后下降趋势，在第 天时活性达到最大值，随后逐渐下降，处理组 活性始终高于对照组，后差异显著（）（图）。结果表明，能显著提高哈密瓜 循环中关键酶的活性。研究报告 年第 卷第 期（总第 期）含量；含量；含量；含量；图 熏蒸对哈密瓜、含量及 、的影响 ，酶活性；酶活性；酶活性；酶活性图 熏蒸对哈密瓜、和 酶活性的影响 ，食品与发酵工业 （）讨论抗氧化防御系统失衡导致 积累、氧化膜损伤、细胞壁结构破坏和抗病原菌能力减弱，加剧采后果实的失水变软和致病菌感染。本文中，相对于对照组果实，果实经 熏蒸处理后有效降低了腐烂率，抑制了果实水分的流失，较好地保持了果实硬度，维持了哈密瓜的采后品质。等研究报道了 可延缓采后桃果实的衰老，维持采后贮藏品质，这与本文的结果一致。等用不同浓度的 供体硝普钠（，）处理苎麻叶片后发现，亚硝基化水平与外源施加的 浓度含量存在正相关关系，并使用特异性的 清除剂（）证明了外源 提高细胞 亚硝基化水平很可能是由于其促进了苎麻叶片细胞内源 含量的增加。由图 可知，施加 使内源 快速积累并在 时含量达到最高。可以调节植物体内整体 亚硝基化的水平。通过特异性识别和降解 可分解为 和 来调节真核细胞中 和 的水平。可能通过抑制 的活性从而阻止 对亚硝基化水平的抑制。在本文中，由于 降低了哈密瓜 的活性，导致 对 的降解活性下降，导致 在哈密瓜果实中积累。由图 和图 可知，在 时可能抑制了 酶活性并提高了内源 的产生，这说明 在 诱导过程中调节了 的总含量。这也进一步说明了外源施加 可能提高了 亚硝基化水平。等研究报道了同样研究结果，用 气体处理的拟南芥植物 含量明显高于未处理组。此外 等研究发现，显著提高了黄瓜、含量，降低了 酶活性，并鉴定 亚硝基化蛋白后发现，提高了 亚硝基化蛋白的丰富度。在抗氧化系统失衡的的情况下，能够被迅速地诱导，并且大量产生。高浓度 会加速膜脂过氧化，产生，对细胞进一步造成氧化损伤，导致果蔬品质下降。由图 和图 可知，贮藏过程中处理组哈密瓜、含量被抑制了。这可能是 激活了抗氧化机制的信号，提高了哈密瓜对的清除能力，减少了 的生成，保持了哈密瓜果实的品质。在香蕉中也发现了类似的 效应。外源 诱导的内源 含量在贮藏前期快速升高并快速下降，说明内源 的积累只能持续较短时间，而 含量在贮藏中后期维持着较低的水平。这表明，外源 通过提高内源 依赖的 亚硝基化水平来维持较高的 清除能力，抑制后续过多 的积累，保持哈密瓜的贮藏品质。和 能在多种酶促或非酶促反应中作为电子供体参与缓解氧化胁迫对细胞的伤害，是直接和间接的 清除剂。和 含量以及 和 反映了植物的氧化还原状态，较高的还原电位有利于维持植物正常的细胞功能和抵抗氧化胁迫。在本文中，与对照组相比 处理组以增加 和 的含量（图，图）和降低 和 含量（图，图）来维持了较高比例的 和 （图，图）。外源 能够通过提高 和 维持氧化还原稳态，从而在哈密瓜抗氧化胁迫中发挥重要的作用。等研究发现冷胁迫下，通过提高、含量和 、，显著缓解了黑麦草幼苗叶片的 和 的积累。蛋白质 亚硝基化是调控蛋白质活性的重要机制。可以通过硝化和 或 亚硝基化调控 循环中的大多数酶。在 循环过程中，、和 是参与 的必要抗氧化酶，这些关键酶相互协调作用从而激活了 的再循环过程。由图 图 可知，处理组、的酶活性显著提高。虽然通过提高 活性提高 消耗，但也通过提高、活性加速、的还 原 生 成，导 致 含 量 的 升 高。由 于 活性提高，更多的 转化成了，少部分的 歧化生成了，导致 含量下降。可能因为 活性的增加加速了 的转化，使 含量下降，从而提高 。活性的增加加快了 转化成 的速度，降低了 含量，提高了 含量，也可能因为 活性的上升增加了对 的需求，提高了 的含量和 。增加的 活性提升了 转化成 的速度。可以推测，较高的 亚硝基化水平激活酶活性，并促进了 和 的还原，加速了 和 的再生，从而提高了 再循环的能力，抑制了 含量的增加。上述结果解释了 如何能减少 的积累，从而维持哈密瓜品质。等研究发现拟南芥胞质 的 为研究报告 年第 卷第 期（总第 期）亚硝化位点，亚硝基化使其酶活性增强。等研究确定了豌豆、的硝化和 亚硝化位点，亚硝化使 活性增加，而使 性降低。综上所述，外源 在短期内诱导的内源 可能通过较高的 亚硝基化水平调控长期的植物代谢相协调的抗氧化作用。提高了哈密瓜 亚硝基化水平，激活了、和 的活性，从而提高了氧化胁迫下哈密瓜 循环清除 的能力，维持了细胞氧化还原平衡，保持了哈密瓜的品质。此外，本文验证了 亚硝基化是外源 重要的作用方式之一，为研究一氧化氮调控果实采后的抗氧化机制提供了新思路。参考文献 张润光，王良艳，黄丽婉 甜瓜贮藏保鲜技术研究进展 保鲜与加工，（）：，（）：王懿，侯媛媛，马钰晴，等 甘氨酸甜菜碱处理对桃果实冷害及抗坏血酸谷胱甘肽循环代谢的影响 食品科学，（）：，（）：，“”，：张静 盐胁迫下 和蛋白质 亚硝基化对番茄幼苗生长发育的影响 兰州：甘肃农业大学，：，：黄波，陈畅 一氧化氮的功能及其作用机制（）：蛋白质巯基亚硝基化修饰 生物物理学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王鲁阳，吴斌，敬媛媛，等一氧化氮（）熏蒸提高哈密瓜果实采后贮藏的耐冷性现代食品科技，（）：；，（）：；田全明，王曼，魏佳，等 真空预冷结合氮气处理对新疆小白杏采后品质的影响 食品与发酵工业，（）：，（）：，（，：），（）：，（），（）：，（）：曹建康，姜微波，赵玉梅 果蔬采后生理生化实验指导北京：中国轻工业出版社，：，：，：，（），（）：，（）：，（）：，：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，食品与发酵工业 （），（）：，（），（）：，（，）（，）（，）（）（），（）（）（），（）（），（），（）（），（），（），（），；