荧光定量CR的原理及临床应用2学生讲HCMVppt课件.ppt

荧光定量光定量PCR的原理及的原理及临床床应用用苏晓霁1.如何做一个如何做一个“聪明明”的的实习生生l实习的目的就是的目的就是对在校所学的理在校所学的理论知知识和和实验技技能，在能，在临床的床的实际工作中工作中进行行实践、巩固和提高。践、巩固和提高。l如何做到：如何做到：实习之前要复之前要复习理理论知知识和和实验课内容内容 “理理论先行先行”实习过程中要程中要“聪明明”做好做好实习笔笔记，用心思考，用心思考，实习之外下功夫之外下功夫2.如何做一个如何做一个“聪明明”的的实习生生聪明明耳：耳：认真听老真听老师的的说明和明和讲解解看：仔看：仔细看老看老师的操作的操作问：有疑：有疑问要多提要多提问，多，多讨论心：要用心去思考心：要用心去思考日月：要每天每月日月：要每天每月坚持做到持做到3.内容概要内容概要lPCR的定的定义和原理和原理l荧光定量光定量PCR的原理和分的原理和分类l荧光定量光定量PCR结果的分析果的分析l荧光定量光定量PCR在在临床的床的应用用4.PCR的定的定义lPCR是是Polymerase Chain Reaction的的缩写，中写，中文称文称为聚合聚合酶链式反式反应，由，由变性、退火及延性、退火及延伸几步反伸几步反应组成一个周期成一个周期,循循环进行行,可使目的可使目的DNA得以迅速得以迅速扩增。增。l由美国由美国PE公司公司遗传部的部的Dr.Mullis发明，由于明，由于PCR技技术的跨的跨时代意代意义，Mullis获得了得了1993年年诺贝尔化学化学奖。5.PCR的原理的原理l变性：双性：双链DNA在高温下解开成在高温下解开成单链的的过程程。温。温度一般度一般为95左右。左右。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT55CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5加加热6.PCR的原理的原理l退火：温度下降后，两条配退火：温度下降后，两条配对的的单链DNA重新重新结合合为双双链的的过程。温度一般程。温度一般为5060。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT降降温温7.PCR的原理的原理l延伸：延伸：DNA聚合聚合酶催化以引物催化以引物为起始点的起始点的DNA链延伸反延伸反应。温度一般。温度一般为72左右。左右。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGAGGTGACGGAGAG GGACTCGACACT恒恒温温8.普通普通PCR的原理的原理9.普通普通PCR的原理的原理lPCR反反应成分：成分：1.模板模板DNA 2.引物引物 3.四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合聚合酶(Taq酶)5.反反应缓冲液、冲液、Mg2+等等 6.荧光探光探针（荧光定量光定量PCR）10.Taq酶的的发现l在在Taq酶发现之前，之前，实验室的室的PCR反反应中运用的中运用的是大是大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶的的Klenow片段。片段。lKlenow酶不耐高温，不耐高温，90加加热后会后会变性失活，性失活，每次循每次循环结束都要加入新束都要加入新鲜的的酶。l而且而且DNA的延伸是在的延伸是在37完成，模板和引物容完成，模板和引物容易易错配，造成反配，造成反应的特异性很差。的特异性很差。11.Taq酶的的发现l美国的嗜美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜了嗜热菌菌(Thermus aquaticus)株，株，Cetus公司公司研究人研究人员从中分离了从中分离了Taq DNA聚合聚合酶l特点：特点：耐高温：耐高温：70 2h 活性活性90%，93 2h 活性活性60%，95 2h 活性活性40%；延伸延伸温度温度较高高(一般一般为72)：大大提高了：大大提高了扩增特异增特异性、灵敏性和性、灵敏性和扩增效率。增效率。12.荧光定量光定量PCRl概念：在概念：在PCR反反应中加入中加入荧光基光基团，利用，利用荧光光信号累信号累积或或变化化实时监测整个反整个反应过程，最后程，最后通通过特定数学模型特定数学模型对未知模板未知模板进行定量分析的行定量分析的方法。方法。l实时荧光定量光定量PCR技技术于于1996年由美国年由美国Applied Biosystems，ABI公司推出，公司推出，实现了了PCR从定性从定性到定量的到定量的飞跃。13.实时荧光定量光定量PCR的原理的原理l利用利用荧光信号的光信号的变化化实时监测PCR反反应的每个循的每个循环的的扩增增产物量的物量的变化。化。l通通过Ct值和和标准曲准曲线分析分析对起始起始标本本的模板量的模板量进行定量分析。行定量分析。14.与普通与普通PCR的比的比较l普通普通PCR完成后，一般只完成后，一般只对扩增的最增的最终产物量物量进行分析，分析行分析，分析结果多果多为定性定性或者半定量或者半定量结果。果。l荧光定量光定量PCR通通过监测荧光光值的的变化，化，体体现每一个循每一个循环的的扩增增产物量的物量的变化，化，分析分析结果果为定量定量结果。果。15.与普通与普通PCR的比的比较l普通普通PCR完成后，才能完成后，才能进行行扩增增产物的分物的分析，而且分析的析，而且分析的过程可能程可能产生一定的生生一定的生物危害和物危害和环境境污染。染。l荧光定量光定量PCR的的扩增和增和产物分析物分析过程是同程是同时完成的，而且在封完成的，而且在封闭的反的反应体系中体系中进行，比行，比较安全，易于安全，易于处理。理。16.常用的名常用的名词概念概念l本底信号（本底信号（Baseline）l荧光光阈值（Threshold）lCt值（Ct value）l扩增曲增曲线前前15个循个循环荧光信号的均光信号的均值，可，可手手动调节选择默默认是第是第315个循个循环的的荧光信号的光信号的标准偏差的准偏差的10倍，也可手倍，也可手动调节扩增增过程中，程中，产物的物的荧光信号达到光信号达到设定的定的阈值时所所经过的的扩增循增循环数数17.常用的名常用的名词概念概念ThresholdBaselineCtvalue荧光光强度度Rn扩增循增循环数数对数增数增长期期18.实际中的运用中的运用左左图为5个数量个数量级的的标准品准品扩增后得到的增后得到的荧光曲光曲线，右右图以以Ct值为纵坐坐标，lgXs为横坐横坐标，可，可计算得出算得出标准曲准曲线19.实时荧光定量光定量PCR的分的分类l目前的目前的实时荧光定量光定量PCR均是基于均是基于荧光共振能光共振能量量转移（移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理。）的原理。FQ10nmFFluorophore,荧光基光基团QQuencher，淬淬灭基基团FQ10nm20.荧光共振能量光共振能量转移（移（FRET）发生的条件生的条件l荧光基光基团和淬和淬灭基基团都能都能发射射荧光光l荧光基光基团的的发射光射光谱和淬和淬灭基基团的激的激发光光谱需需有效重叠有效重叠l荧光基光基团和淬和淬灭基基团应足足够的近（的近（500bp片段敏感片段敏感 75%或无水乙醇溶液或无水乙醇溶液喷雾32.荧光定量光定量PCR在在临床的床的应用用l在反在反应体系中使用体系中使用dUTP和和UNG酶消除以消除以往往实验的的污染影响染影响 UNG酶（尿（尿嘧啶-N-糖基化糖基化酶）：）：选择性性水解断裂含有水解断裂含有dU的双的双链和和单链中的尿中的尿嘧啶糖苷糖苷键，在碱性介，在碱性介质和高温下会和高温下会进一步一步水解断裂，水解断裂，酶的最佳活性温度是的最佳活性温度是50，在，在95 失活。失活。33.荧光定量光定量PCR在在临床的床的应用用气溶气溶胶胶污染物染物50 2min，95灭活加入加入UNG酶34.荧光定量光定量PCR在在临床的床的应用用5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3扩增增加入加入dUTP5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3潜在气溶胶潜在气溶胶污染物染物502min加入加入UNG酶5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段335.荧光定量光定量PCR在在临床的床的应用用l乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)lEB病毒病毒DNA(EBV-DNA)l人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA(HCMV-DNA)l肺炎支原体肺炎支原体DNA(MP-DNA)l肺炎衣原体肺炎衣原体DNA(CP-DNA)36.临床床标本的采集本的采集检 测 项 目目标 本本 类 型型 及及 要要 求求HBV-DNA血清或者血血清或者血浆 100l(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)EBV-DNA血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)HCMV-DNA血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)MP-DNA CP-DNA咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液 1ml37.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l用于器官移植、骨髓移植及用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性阳性/AIDS患者人巨患者人巨细胞病毒感染的胞病毒感染的辅助助诊断断和和疗效效监控。控。l临床上可以采用的床上可以采用的标本本类型：尿液、乳型：尿液、乳汁、血清、血汁、血清、血浆或淋巴或淋巴细胞胞样本中人巨本中人巨细胞病毒胞病毒DNA。38.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l巨巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（血清或血的提取（血清或血浆）100l血清血清或血或血浆100lDNA浓缩液液去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，10min39.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒巨巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（血清或血的提取（血清或血浆）加入加入50lDNA提提取液取液剧烈振烈振荡混匀混匀5-10s100加加热10min40.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l巨巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（血清或血的提取（血清或血浆）4放置放置或用于或用于PCR振振荡混匀混匀510s12000rpm，5min41.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l巨巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁）1ml尿液尿液或乳汁或乳汁去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，5min42.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l巨巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁）加入加入50lDNA提提取液取液剧烈振烈振荡混匀混匀5-10s100加加热10min43.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l巨巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁）4放置放置或用于或用于PCR振振荡混匀混匀510s12000rpm，5min44.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（淋巴的提取（淋巴细胞的提取）胞的提取）1ml抗抗凝全血凝全血1ml生生理理盐水水0.3ml淋巴淋巴细胞分离液胞分离液45.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（淋巴的提取（淋巴细胞的提取）胞的提取）水平离心机水平离心机2500rpm，15min淋巴淋巴细胞胞层吸取淋巴吸取淋巴细胞胞悬液液46.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（淋巴的提取（淋巴细胞的提取）胞的提取）淋巴淋巴细胞胞悬液液去除上清去除上清液，保留液，保留沉淀沉淀12000rpm，5min47.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA定量定量检测试剂盒盒l人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（淋巴的提取（淋巴细胞的提取）胞的提取）加入加入50lDNA提提取液取液剧烈振烈振荡混匀混匀5-10s100加加热10min48.人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA检测试剂盒盒l人巨人巨细胞病毒胞病毒DNA的提取（淋巴的提取（淋巴细胞的提取）胞的提取）4放置放置或用于或用于PCR振振荡混匀混匀510s12000rpm，5min49.荧光定量光定量PCR扩增增过程程50942min5min9315s5730sStage1Stage2Stage345 1 1251minStage4 150.DNA浓缩液的作用液的作用lDNA浓缩液的成分：液的成分：PEG6000、NaCllPEG（聚乙二醇）的作用：（聚乙二醇）的作用：PEG与自由水分子与自由水分子结合，同合，同时蛋白蛋白质表面的水化膜被表面的水化膜被夺走，与水走，与水分子分子结合的极性集合的极性集团转而与多聚物的氧原子或而与多聚物的氧原子或者者氢氧根氧根结合，形成蛋白合，形成蛋白质与多聚物的复合体，与多聚物的复合体，从溶液中沉淀析出。提高低从溶液中沉淀析出。提高低浓度度标本的本的检出率。出率。lPEG的的浓度与沉淀出的度与沉淀出的DNA片段大小成反比。片段大小成反比。51.DNA浓缩液的作用液的作用lNaCl的作用：在的作用：在细胞内胞内DNA与蛋白与蛋白质结合成脱合成脱氧核糖核蛋白氧核糖核蛋白DNP，而，而RNA与蛋白与蛋白质结合成合成为核糖核蛋白核糖核蛋白RNP,在不同在不同盐浓度中二者溶解度不度中二者溶解度不一一样。lDNP在在纯水或者水或者12M的的Nacl溶解度溶解度较大，在大，在0.14M溶解度溶解度较低，而低，而0.14M中中RNP溶解度溶解度较大，大，因此利用因此利用0.14M可分离可分离RNP和和DNP。52.DNA提取液的作用提取液的作用lDNA提取液的主要成分：提取液的主要成分：NP-40 TritonX-100 Chelex-100 EDTA(pH8.0)Tris-HCl(pH 8.0)NaOH（乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢（乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破度的基本可以破坏掉胞膜，而坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱核膜破坏的作用弱（聚乙二醇辛基苯基（聚乙二醇辛基苯基醚）一种非离子性去垢）一种非离子性去垢剂，被用来做被用来做细胞破膜胞破膜剂/细胞通透胞通透剂（聚苯乙（聚苯乙烯二乙二乙烯基苯）提取基苯）提取DNA过程中，程中，Chelex100能有效除去非核酸有机物能有效除去非核酸有机物螯合螯合Mg、Ca等二价金属离子，抑制依等二价金属离子，抑制依赖金属离金属离子的脱氧核糖核酸子的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用的降解作用（三（三羟甲基氨基甲甲基氨基甲烷）与）与盐酸按比例混合后形成的一种酸按比例混合后形成的一种缓冲液体系，冲液体系，DNA在在这一一体系中呈体系中呈稳定定态核酸在核酸在pH 59是是稳定的，定的，pH12/3会引起双会引起双链之之间氢键解离而解离而变性性53.淋巴淋巴细胞分离液的作用胞分离液的作用l人外周血中各种人外周血中各种细胞的密度不同，胞的密度不同，红细胞胞为1.093，粒，粒细胞胞为1.092，淋巴，淋巴细胞胞为1.0740.001。l淋巴淋巴细胞分离液密度胞分离液密度为1.0771.080g/ml，密度，密度梯度离心法原理是根据各梯度离心法原理是根据各类血血细胞比重的差异，胞比重的差异，利用比重介于某两利用比重介于某两类细胞之胞之间的的细胞分离液胞分离液对血液血液进行离心，使血行离心，使血细胞按照相胞按照相应的密度梯度的密度梯度分布于不同的位置，从而达到分离的效果。分布于不同的位置，从而达到分离的效果。54.？问？题？lPCR的中文名称，一般包括哪几个反的中文名称，一般包括哪几个反应过程？程？l在在PCR中我中我们常用到的常用到的酶是什么？有什么是什么？有什么优点？点？l荧光共振能量光共振能量转移的原理？移的原理？l有效防止和消除气溶胶有效防止和消除气溶胶污染的方法？染的方法？l在在临床血液床血液标本采集中哪种抗凝本采集中哪种抗凝剂不能使用？不能使用？l淋巴淋巴细胞分离液的作用原理？胞分离液的作用原理？55.后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用56.主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！57.致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求58.感感谢您的您的观看和下看和下载The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field59.