低温缺氧_复氧后大鼠心肌成...肌H9c2细胞间通讯的影响_佟睿.pdf

实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9低温缺氧/复氧后大鼠心肌成纤维细胞对心肌H9c2细胞间通讯的影响佟睿1，2高鸿3安丽3易菁3曹莹4蒙富雪5吴学艳1马艳燕11贵州医科大学麻醉学院（贵阳 550000）；2哈尔滨医科大学附属第六医院麻醉科（哈尔滨 150000）；3贵州医科大学附属医院麻醉科（贵阳 550000）；4贵州医科大学附属金阳医院麻醉科（贵阳 550000）；5贵州医科大学第三附属医院医学实验中心（贵州都匀 558000）【摘要】目的观察低温缺氧/复氧（hypothermia hypoxia/reoxygen，H/R）后大鼠心肌成纤维细胞（ratcardiac fibroblasts，RCFs）对心肌H9c2细胞间通讯的影响并探讨其可能机制。方法将RCFs细胞与H9c2细胞以2:1数量比Transwell共培养后随机分为6组。其中T+Ang组及H/RT+Ang组加入1.5 nmol/L Ang，T+ARB组及H/RT+ARB 组加入1 nmol/L 缬沙坦。T组、T+Ang组及T+ARB组进行正常培养，H/RT组、H/RT+Ang及H/RT+ARB组进行H/R处理。检测各组培养液中Ang含量；H9c2细胞Cx43、ERK1/2表达量及磷酸化及细胞间通讯情况。结果与T组相比，H/RT组及T+Ang组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平降低（P 0.05），细胞间通讯减弱（P 0.05）；T+ARB组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平增高（P 0.05），细胞间通讯增强（P 0.05）。与 H/RT 组相比，H/RT+Ang组 H9c2 细胞ERK1/2、Cx43 表达及磷酸化水平降低（P 0.05），细胞间通讯减弱（P 0.05）；H/RT+ARB 组 H9c2 细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平增加（P 0.05），细胞间通讯增强（P 0.05）。结论H/R处理后，RCFs细胞分泌增多的Ang可能通过抑制H9c2细胞MAPK/ERK通路下调Cx43表达，导致H9c2细胞间通讯减弱。【关键词】低温缺氧/复氧；心肌成纤维细胞；H9c2细胞；缝隙连接蛋白43；细胞间通讯【中图分类号】R654.1Effect of rat cardiac fibroblasts on H9c2 cardiomyocytes intercellular communication after hypothermiahypoxia/reoxygenationTONG Rui*，GAO Hong，AN Li，YI Jing，CAO Ying，MENG Fuxue，WU Xueyan，MAYanyan.*School of Anesthesiology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；*Department of Anesthesiology，the Sixth Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Haerbin 150000，ChinaCorresponding author：GAO HongEmail：【Abstract】ObjectiveTo observe the effect on myocardial H9c2 cells gap junction intercellular communication（GJIC）by rat cardiac fibroblasts（RCFs）after hypothermia hypoxia/reoxygen（H/R）and to explore the possible mechanisms.MethodsAfter cocultured of RCFs cells with H9c2 cells in a 2:1 number ratio by Transwell，cells was randomly divided into 6 groups.The T+Ang group and H/RT+Ang group were added 1.5nM Ang，and the T+ARB group and H/RT+ARB group were added 1nM valsartan.The T group，T+Ang group and T+ARB group were cultured normally，and the H/RT group，H/RT+Ang and H/RT+ARB group were treated withH/R.The Ang concentration in the culture medium；the expression and phosphorylation of Cx43 and ERK1/2；and GJIC of H9c2 cells were detected.ResultsCompared with the T group，the expression and phosphorylationof ERK1/2 and Cx43 were decreased（P 0.05）and GJIC was diminished（P 0.05）in H9c2 cells in the H/RTand T+Ang II group;he expression and phosphorylation of ERK1/2 and Cx43 were increased（P 0.05）and GJICwas enhanced（P 0.05）in H9c2 cells in the T+ARB group.Compared with H/RT group，he expression andphosphorylation of ERK1/2 and Cx43 were decreased（P 0.05）and GJIC was diminished（P 0.05）in H9c2cells in H/RT+Ang II group;and the expression and phosphorylation of ERK1/2 and Cx43 were increased（P 0.05）and GJIC was diminished（P 0.05）in H9c2 cells in H/RT+ARB group.ConclusionAfter H/R，increased Ang secretion by RCFs may downregulate Cx43 expression by inhibiting the MAPK/ERK pathway inH9c2 cells，resulting in diminished GJIC between H9c2 cells.【Key words】hypothermia hypoxia/reoxygenation；cardiac fibroblasts；H9c2 cells；connexin 43；gap junction intercellular communication基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.10065725.2023.09.004基金项目：贵州省卫生健康委科学技术基金项目（编号：gzwkj2021270，gzwkj2022131）通信作者：高鸿Email：1086实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9再灌注心律失常是体外循环下行心脏手术后，心脏缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/RI）的主要并发症，其中主要为室性心律失常。心脏再灌注心律失常与心肌细胞间通讯及电同步性相关13。缝隙连接蛋白 43（connexin 43，Cx43）是一种广泛存在于心肌细胞的缝隙连接蛋白，主要在心室肌中表达46。其通过细胞间物质传递而稳定电化学信号7，进而稳定心肌电生理89。健康成年人的心肌中，心肌成纤维细胞占总细胞数量的60%70%10，能够导致心脏生物电传导减慢或阻滞，启动局部折返，并迫使冲动进入缓慢而迂回的传导通路，形成折返环导致心律失常的发生11。本课题组的前期研究中发现，低温缺氧/复氧（hypothermic hypoxia/reoxygenation，H/R）后 RCFs 细胞的培养液能够使得正常心肌细胞（cardiac myocytes，CMs）的死亡率增加、Cx43 表达量下降12 13，进而导致缝隙连接通讯功能（Gapjunction intercellular communication，GJIC）减弱，从而影响心肌细胞间电同步，诱发心律失常，但具体通过何种物质与其作用机制都尚不明确。CAO等14及 SALAMEH 等15的研究表明，Cx43 的表达受到ERK1/2磷酸化的调控，这也被我们的前期研究所证实16。血管紧张素（Angiotensin，Ang）是一类具有极强的缩血管和刺激肾上腺皮质分泌醛固酮等作用的肽类物质。研究发现，Ang能够调控心肌细胞Cx43的表达，且该种作用能够被血管紧张素受体抑制剂（Angiotensin receptorblockers，ARB）所逆转14，17。众所周知，心肌组织中成纤维细胞能够分泌Ang10，18，而心肌细胞几乎无法分泌10。FAN等19证实，Ang能够通过抑制 MAPK/ERK 通路激活下调大鼠心肌 H9c2 细胞Cx43的表达。因此，本研究将大鼠心肌成纤维细胞（rat cardiac fibroblasts，RCFs）与大鼠心肌 H9c2细胞共培养后 H/R 处理，假设 H/R 能通过促进RCFs 细胞 Ang的分泌，影响心肌细胞 MAPK/ERK通路的激活，下调H9c2细胞Cx43表达及磷酸化，进而减弱细胞间通讯，以期为缺血/再灌注后心肌细胞通讯减弱及心律失常的发生提供理论依据。1资料与方法1.1细胞培养与传代RCFs 细胞购自上海弘顺生物科技有限公司，H9c2心肌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，均为种属鉴定正确细胞。使用含有 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）（BI，以色列）和 1%青霉素链霉素的高糖培养基（Dulbeccos modified eagle medium，DMEM）（赛维尔，中国）于37 5%CO2+95%空气条件下进行培养。每 48 h 进行 1 次换液，待细胞密度达到 90%后，用0.25%含EDTA的胰酶消化后传代。选取10代以内的细胞进行实验以保证细胞活力。1.2分组及处理将 1105个/孔的 H9c2 细胞接种于 Transwell 培养小室的下层，2105个/孔 RCFs细胞接种于 Transwell 培养小室的上层，充分混匀后静置培养待细胞贴壁。将共培养的细胞随机分为6组，每组12孔。分别命名为共培养组（T组）、H/R共培养组（H/RT组）、共培养+Ang组（T+Ang组）、H/R共培养+Ang组（H/RT+Ang组）、共培养+ARB 组（T+ARB 组）及 H/R 共培养+ARB 组（H/RT+ARB组）。将细胞换液：T组及H/R组换用新鲜DMEM完全培养基，T+Ang组及H/RT+Ang组换用含 1.5 nmol/L Ang（APOxBIO，美国）的新鲜DMEM完全培养基，T+ARB组及H/RT+ARB组换用含1 nmol/L缬沙坦（APOxBIO，美国）的新鲜DMEM完全培养基。细胞换液后T组、T+Ang组及 T+ARB 组在正常培养条件（37 5%CO2+95%空气）下培养 5 h，H/R 组、H/RT+Ang组及 H/RT+ARB组置于密闭缺氧装置中，以5 L/min的流速持续吹入95%N2+5%CO2的混合气体15 min，关闭进出气口，使用便携型气体浓度监测仪（上海雨沃仪器设备有限公司，中国）监测装置内各种气体浓度。参照 NIU 等13及我们的前期实验方案，将该装置置于4 冰箱中低温缺氧培养1 h后，取出细胞培养板恢复正常培养条件后复氧培养 4 h。造模后保存各组细胞培养液上清及 H9c2 细胞待检测。1.3ELISA法检测细胞培养液Ang浓度大鼠血管紧张素酶联免疫分析试剂盒购自上海酶联生物科技公司。按ELISA试剂盒说明书提取各组细胞培养液并测定培养液中Ang的浓度。无菌环境下提取各组细胞培养液，在 4 下，3 000 r/min 低温离心20 min 获取上清液。使用大鼠血管紧张素酶联免疫分析试剂盒对Ang浓度进行测量。按说明书顺序加样、加酶、温育、洗涤、显色后，终止反应15 min，使用酶标仪检测450 nm波长下各实验孔的 OD 值。通过标准曲线计算 Ang的浓度。1.4Western blot 法测 H9c2 细胞 Cx43、pCx43、ERK1/2及pERK1/2的相对表达量变化按总蛋白提取试剂盒（购自武汉赛维尔生物科技有限公司）说明书提取总蛋白并用Western blot 法测定蛋白相对含量。每组细胞分别按说明加入适量细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上混匀反应后用细胞刮刮取细胞，收集悬液。在4 下，半径15 cm、1087实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.912 000 r/min 低温离心 20 min 获取总蛋白。使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（购自武汉赛维尔生物科技有限公司）对总蛋白进行定量。根据蛋白分子量大小制备5%积层胶和12%分离胶，积层胶电压80 V，分离胶电压120 V电泳，运行半干转Standard程序30 min进行转膜，封闭液室温振荡封闭1 h后，分别在4条件下孵育一抗过夜，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（M21001，艾比玛特生物医药有限公司，中国，1 5 000）室温振荡孵育2 h。ECL显色后曝光显影。以内参蛋白 GAPDH 条带灰度值作为标准，使用Image J 2x软件计算相应蛋白的相对含量。一抗包括：兔抗大鼠抗Cx43抗体（SigmaAldrich，德国，1 8 000）、兔抗大鼠抗磷酸化 Cx43（S368）抗体（CST，美国，1 1 000）、兔抗大鼠抗ERK1/2 抗体（万类，中国，1 500）、兔抗大鼠抗磷酸化ERK1/2抗体（万类，中国，1 300）。1.5免疫细胞荧光法检测 H9c2 细胞 Cx43 及ERK1/2 的荧光强度变化用 4%多聚甲醛（阿拉丁，中国）固定细胞爬片 20 min 后，使用 0.2%TritonX100PBS（索莱宝，中国）孵育 5 min，再用 5%牛血清白蛋白（赛维尔，中国）室温孵育1 h。用一抗于 4 孵育 10 h；然后用 FITC 标记的山羊抗兔二抗（SF134，北京索莱宝科技有限公司，中国，1 100）室温避光孵育1 h，DAPI染液（索莱宝，中国）避光染色细胞核后封片。在荧光共聚焦显微镜（Nikon A1+型，尼康，日本）下用同等条件观察细胞爬片并拍摄。在低倍镜下选择各细胞爬片同一坐标定位，转换为高倍镜后选择四角及正中 5 个视野观察。使用ImagePro Plus 6.0软件分析细胞荧光强度，取平均值。一抗包括：兔抗鼠抗 Cx43抗体（SigmaAldrich，德国，1 2 000）和 ERK1/2（万类，中国，1 500）。1.6荧光划痕染料标记示踪法测H9c2细胞间通讯改变吸除细胞培养六孔板中旧培养基并使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗干净。每孔加入0.05%的萤光黄（Lucifer Yellow，LY，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国）染料2 mL，用手术刀尖在培养孔底部轻划三条线。将各组细胞置于正常培养条件下染色 5 min后，使用PBS液彻底清洗干净。使用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定后，置于倒置荧光显微镜下使用532 nm波长的激发光激发，并进行拍摄。记录划痕两侧LY染料染色的细胞排数。1.7统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计分析。正态分布计量资料以均数标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，事后比较采用LSDt检验法进行组间两两比较。以P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组细胞培养液上清中Ang浓度的变化与 T 组相比，H/RT 组的 Ang组浓度增加（P 0.05）；与 T+Ang组相比，H/RT+Ang组的 Ang浓度增高（P 0.05）；与T+ARB组相比，H/RT+ARB组的Ang浓度增高（P 0.05）。见表1。2.2各组H9c2细胞的Cx43表达量及磷酸化的变化与T组相比，T+ARB组Cx43的表达量及磷酸化水平增高（P 0.05），T+Ang组、H/RT+Ang组Cx43的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05）；与T+Ang组相比，T+ARB 组 Cx43 的表达及磷酸化水平增高（P 0.05），H/RT+Ang组Cx43的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05）；与H/RT组相比，H/RT+Ang组Cx43的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05），H/RT+ARB 组 Cx43 的表达量及磷酸化水平增高（P 0.05）；与H/RT+Ang组相比，H/RT+ARB 组 Cx43 的表达量及磷酸化水平增高（P 0.05）；与T+ARB组相比，H/RT+ARB组H9c2细 胞 Cx43 的 表 达 量 及 磷 酸 化 水 平 降 低（P 0.05）。见表2。2.3各组H9c2细胞ERK1/2的表达量及磷酸化的变化与T组相比，T+ARB组ERK1/2的表达量及磷酸化水平增高（P 0.05），T+Ang组、H/RT+Ang组ERK1/2的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05）；与 T+Ang组相比，T+ARB 组 ERK1/2 的表达及磷酸化水平增高（P 0.05），H/RT+Ang组ERK1/2的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05）；与H/RT组相比，H/RT+Ang组ERK1/2的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05），H/RT+ARB组ERK1/表1各组细胞培养液上清中Ang浓度（n=12）Tab.1The concentration of Ang in the medium of eachgroup（n=12）组别T组H/RT组T+Ang组H/RT+Ang组T+ARB组H/RT+ARB组F值P值浓度（pg/mL）1 435.18 43.282 065.08 50.96*2 879.59 10.393 462.59 67.31#1 403.83 50.311 892.97 27.72327.500.05注：与T组比较，*P 0.05；与T+Ang组比较，#P 0.05；与T+ARB组比较，P 0.05x s1088实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.92的表达量及磷酸化水平增高（P 0.05）；与H/RT+Ang组相比，H/RT+ARB 组ERK1/2的表达量及磷酸化水平增高（P 0.05）；与T+ARB组相比，H/RT+ARB组H9c2细胞ERK1/2的表达量及磷酸化水平降低（P 0.05）。见表3。2.4各组H9c2细胞间通讯的改变与T组相比，表2各组H9c2细胞的Cx43表达量及磷酸化的变化（n=12）Tab.2Expression and phosphorylation of Cx43 in each group（n=12）组别T组H/RT组T+Ang组H/RT+Ang组T+ARB组H/RT+ARB组F值P值Cx43相对表达量0.91 0.010.41 0.02*0.39 0.01*0.31 0.01#1.05 0.04*0.86 0.06#102.020.05pCx43相对表达量0.71 0.010.21 0.02*0.19 0.01*0.11 0.01#0.85 0.04*0.57 0.02#210.860.05pCx43/Cx43相对表达量比值0.78 0.000.52 0.02*0.48 0.01*0.36 0.02#0.81 0.01*0.66 0.04#84.120.05Cx43的荧光强度67.84 3.1522.29 1.09*21.17 1.61*15.34 1.89#76.33 0.70*69.87 0.68#268.830.05注：与T组相比，*P 0.05；与H/RT组相比，#P 0.05；与T+Ang组相比，P 0.05；与H/RT+Ang相比，P 0.05；与T+ARB组相比，P 0.05x s表3各组H9c2细胞ERK1/2表达量及磷酸化的变化（n=12）Tab.3Expression and phosphorylation ERK1/2 in each group（n=12）组别T组H/RT组T+Ang组H/RT+Ang组T+ARB组H/RT+ARB组F值P值ERK1/2相对表达量0.95 0.010.62 0.01*0.49 0.01*0.40 0.01#1.07 0.02*0.81 0.00#520.180.05pERK1/2相对表达量0.78 0.010.44 0.03*0.35 0.01*0.22 0.00#0.95 0.03*0.69 0.01#223.180.05pERK/ERK相对表达量比值0.81 0.010.70 0.06*0.73 0.03*0.54 0.01#0.89 0.03*0.85 0.01#16.990.05ERK1/2的荧光强度159.45 6.17107.67 5.82*60.69 2.49*28.50 2.71#203.01 8.40*126.28 3.37#145.780.05注：与T组相比，*P 0.05；与H/RT组相比，#P 0.05；与T+Ang组相比，P 0.05；与H/RT+Ang相比，P 0.05；与T+ARB组相比，P 0.05x sT+ARB组H9c2细胞GJIC水平增高（P 0.05），T+Ang组、H/RT+Ang组H9c2细胞GJIC水平降低（P 0.05）；与H/RT组相比，H/RT+Ang组H9c2细胞 GJIC 水平降低（P 0.05），H/RT+ARB 组H9c2细胞GJIC水平增高（P 0.05）；与T+Ang组相比，T+ARB 组 H9c2 细胞 GJIC 水平增高（P 0.05），H/RT+Ang组 H9c2 细胞 GJIC 水平降低（P 0.05）；与H/RT+Ang组相比，H/RT+ARB组H9c2细胞GJIC水平增高（P 0.05）。与T+ARB组相比，H/RT+ARB 组 H9c2 细胞 GJIC 水平降低（P 0.05）。见表4。3讨论再灌注心律失常是体外循环下心脏外科手术的常见并发症。这是由于低温缺血/再灌注后，心肌细胞闰盘上的Cx43缝隙连接斑块数量减少、功表4划痕后各组细胞被LY染色的排数（n=12）Tab.4Lines of cell stained with LY after scratch（n=12）x s组别T组H/RT组T+Ang组H/RT+Ang组T+ARB组H/RT+ARB组F值P值染色细胞（排）29.78 1.5410.22 0.62*10.44 0.60*6.44 0.44#34.67 1.27*28.65 0.93#156.800.05注：与 T 组相比，*P 0.05；与 H/RT 组相比，#P 0.05；与 T+Ang组相比，P 0.05；与H/RT+Ang相比，P 0.05；与T+ARB组相比，P 0.051089实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9能减弱2，影响了心肌细胞间通讯及电传导的同步性2021，进而诱发心律失常。健康成年人的心肌组织中，心肌细胞数量仅占总数的30%左右，而剩余的60%70%主要为心肌成纤维细胞，即心肌成纤维细胞与心肌细胞的数量比约为2 122。应用低温缺氧/复氧模型，将RCFs 细胞与 H9c2 细胞以 2 1 的数量比共培养后进行 H/R 处理，能够在细胞水平上较大程度模拟了临床上全心低温缺血/再灌注损伤的病理生理情况。CAO 等14、LEI 等23发现，Ang能够调控多种细胞 Cx43 的表达。SALAMEH 等10的研究表明，Ang的增加能够导致心肌细胞 Cx43 表达的减少。且这种作用可以被ARB药物所拮抗。研究发现23-24，Ang能通过作用于MAPK/ERK通路影响细胞 Cx43 的表达。FAN 等19的研究表明，Ang能够通过抑制 MAPK/ERK 通路下调 Cx43 的表达。众所周知，RCFs细胞具有分泌Ang的功能，而 H9c2 心肌细胞无法分泌 Ang。RCFs 细胞释放的Ang进入细胞外液，自由运输并与H9c2细胞表面上的血管紧张素1型受体（Angiotensin type1 receptor，AT1R）结合，激活H9c2细胞MAPK/ERK通路，进而导致Cx43的表达及磷酸化的增加。我们的前期研究发现16，低温缺氧/复氧后，RCFs细胞能够通过释放某种物质作用于H9c2细胞，致使后者 Cx43 表达减少、磷酸化减弱，且该作用不依赖于细胞间的直接接触。因此，我们假设 H/R 通过促进 RCFs 细胞释放 Ang，影响 H9c2 细胞MAPK/ERK通路的激活，从而对H9c2细胞Cx43表达及细胞间通讯产生影响。本研究结果表明，H/R后，培养液上清中Ang的浓度明显增加。Cx43作为心室肌组织中表达最多的缝隙连接蛋白亚型，是寡聚形成缝隙连接半通道的重要原料蛋白，而其在S368位点的磷酸化被认为是Cx43缝隙连接开放的“开关”25。我们前期研究表明26-27，发生缺血再灌注损伤时，心肌组织中Cx43的表达下降、磷酸化程度减弱，从而导致心肌电传导及电同步性减弱，从而诱发心律失常。本研究结果表明，H/R 条件下，Ang能够加重 H/R 引发的H9c2细胞Cx43的表达及磷酸化下调。这说明，H/R后RCFs细胞Ang分泌的改变可能是其影响H9c2细胞Cx43表达及磷酸化的原因之一。ERK1/2 蛋白是 MAPK/ERK 通路的关键蛋白，其磷酸化水平代表了该通路的激活水平。我们发现，H/R 发生后，H9c2 细胞的 ERK1/2 蛋白的表达及磷酸化水平下降。相似地，外源性的Ang可以模仿这种作用，并且外源性的 Ang也可以加重H9c2 细胞在 H/R 后 ERK1/2 蛋白及磷酸化的下调。这说明，H/R后RCFs细胞对H9c2细胞影响可能是通过MAPK/ERK通路来进行的。GJ具有允许细胞间小分子物质自由交换的功能，是细胞间电同步与电传导的基础。荧光划痕标记示踪法是一种验证细胞间通讯的经典方法，是检验 GJIC 功能最常用的检测手段28。在一定时间内，染料在远离刮痕线一面的扩散的细胞排数或距离是对GJIC功能的定量测量指标。本研究结果显示，H/R 后，心肌 H9c2 细胞间 GJIC 功能有所减弱。同样，外源性的 Ang也能够加重 GJIC的下调。缬沙坦是一种血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin receptor blocker，ARB），能够通过与AT1R结合阻断 Ang的作用。本研究结果表明，无论是RCFs 细胞分泌、还是外源性的 Ang，其对 H9c2细胞 ERK1/2、Cx43 及 GJIC 的影响，均可以被缬沙坦所阻断。综上所述，低温缺氧/复氧后RCFs细胞的Ang分泌量增加，抑制了 H9c2 细胞 ERK1/2 的表达及磷酸化，影响MAPK/ERK通路激活，从而下调了其 Cx43 表达及磷酸化，进而减弱细胞间通讯功能。这可能导致了心肌细胞间缝隙连接通道的物质交换及电同步，从而诱发再灌注心律失常。由于条件所限，本研究尚未从基因通路层面探究其机制。这些也为接下来的研究提供了方向。【Author contributions】TONG Rui performed the experiments andwrote the article.MENG Fuxue，WU Xueyan and MA Yanyan performed the statistical analysis.AN Li，YI Jing and CAO Ying revisedthe article.GAO Hong designed the study and reviewed the article.Allauthors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1OKRUHLICOVA L，TRIBULOVA N，MISEJKOVA M，et al.Gap junction remodelling is involved in the susceptibility of diabetic rats to hypokalemiainduced ventricular fibrillation J.Acta Histochem，2002，104（4）：387391.2张倩，王贵龙，刘艳秋，等.低温缺血再灌注心律失常大鼠心室肌电传导的变化 J.中华麻醉学杂志，2020，40（6）：681683.3何幼芹，高鸿，刘艳秋，等.低温缺血再灌注对心房肌电稳定性的影响 J.临床麻醉学杂志，2019，35（11）：11181121.4DHEIN S，SALAMEH A.Remodeling of Cardiac Gap JunctionalCellCell Coupling J.Cells，2021，10（9）：2422.5陈虹燚，梁仪琳，黄照河.缝隙连接蛋白43与心肌缺血再灌注心律失常的研究进展 J.中国临床新医学，2020，13（6）：635638.6杨博帆，史婧卓，李晶，等.大鼠过劳模型心脏Cx43和Cx45的表达 J.法医学杂志，2019，35（5）：567571.1090实用医学杂志2023年第39卷第9期The 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