黄水中乳酸检测方法的研究开发_李隆淼.pdf

DOI：10.13746/j.njkj.2022115作者简介：李隆淼（1993-），男，大学本科，四川宜宾人，助理工程师，研究方向：分析与检测。通讯作者：罗珠，女，硕士研究生，工程师，E-mail：。黄水中乳酸检测方法的研究开发李隆淼，李杨华，廖勤俭，胡娇，安明哲，罗珠（宜宾五粮液股份有限公司，四川 宜宾 644000）摘要：本研究建立了高效液相色谱（HPLC）快速、准确检测黄水中乳酸含量的分析方法。黄水样品经甲醇振荡除杂，离心过滤取上清液稀释后直接进样，采用Venusil ASB C18色谱柱（4.6 mm250 mm5 m）分离，0.12%H3PO4溶液等度洗脱，流速1 mL/min，检测波长214 nm。在251000 mg/L的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为1，加标回收率为89.47%101.14%。该方法满足方法学精密度的要求，且快速简便、易于操作，可用于黄水中乳酸含量的测定。关键词：黄水；乳酸；高效液相色谱法（HPLC）；检测中图分类号：TS262.3；TS261.7文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）03-0131-03Development of Detection Method of Lactic Acid in Pit Bottom WaterLI Longmiao,LI Yanghua,LIAO Qinjian,HU Jiao,AN Mingzhe and LUO Zhu(Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000,China)Abstract:A rapid and accurate detection method of lactic acid in pit bottom water by high performance liquid chromatography(HPLC)was established.The pit bottom water samples were purified by oscillation in methanol.After centrifuge filtration,the super-natant was diluted and then directly injected.The separation was performed on Venusil ASB C18column(4.6 mm250 mm5 m),the isometric elution was performed with 0.12%H3PO4solution at the flow rate of 1 mL/min,and the detection wavelength was214 nm.The linearity was good in the concentration range of 25 mg/L to 1000 mg/L,the correlation coefficient R2was 1,and the re-coveries were between 89.47%and 101.14%.The method meets the precision requirement,and is easy to operate,which can beused for the determination of lactic acid in pit bottom water.Key words:pit bottom water;lactic acid;high performance liquid chromatography(HPLC);detection乳酸是白酒中最重要的有机酸之一，其含量的高低直接影响酒的口感和后味1。白酒酿造过程中微生物的活动代谢产生大量乳酸，白酒蒸馏过程糟醅中的乳酸通过拖带等作用进入到白酒中，因此酒醅和白酒中乳酸含量均较高。据统计，原酒中乳酸含量较高，为 3661581 mg/L2，作为白酒四大酸（乳酸、乙酸、丁酸和己酸）之一，分析其含量是检测工作中重要的环节之一。白酒和糟醅中乳酸的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、比色法、综合法、离子色谱法等3-6。黄水作为白酒固态发酵过程中重要的副产物，乳酸含量极高，但黄水中乳酸的检测报道不多见，仅有的报道均是对黄水进行简单稀释过滤的前处理后用液相色谱法测定。梅婕7对黄水经离心和稀释的前处理后，以甲醇和磷酸二氢铵的水溶液为流动相，通过安捷伦 Poroshell 120 EC C18色谱柱（4.6 mm150 mm）进行分离，样品的回收率较高、精密度良好；马金同8将黄水样品经稀释、过滤，直接进样，以 0.02 mol/L磷酸二氢钾作流动相，采用Acquity HSS T3 色谱柱（100 mm2.1 mm1.8 m）分离，建立了黄水中乳酸的分析检测方法，精密度和回收率均满足方法学要求。酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)131131酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)本研究改进了前人对黄水的前处理方法，采用甲醇震荡除杂后进样的方式，既保持了乳酸的纯度也避免了黄水中大量大分子蛋白、纤维素等对色谱柱的污染。方法学验证表明该方法精密度良好、回收率较高，同时延长了色谱柱寿命，可用于黄水中乳酸的批量检测。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器样品：四川某酒企黄水样品。试剂：甲醇（LC/MS级，纯度99.5%，Sigma）；乳酸（色谱纯，纯度89.8%，ACROS）；磷酸（分析纯，纯度85%，西陇化工股份有限公司）。仪器设备：超高效液相色谱仪（Agilent 1100 se-ries），美国安捷伦科技公司，配二极管阵列检测器；超纯水发生器（Milli-Q Integral 3），美国 Millipore公司；万分之一分析天平（AE200），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；移液枪（Eppendorf）；0.2 m有机滤膜（希波氏），太仓道邦色谱科技有限公司。1.2实验方法磷酸溶液的制备：准确量取 1.2 mL 磷酸至1000 mL容量瓶中，超纯水溶解并定容至1000 mL，超声振荡均匀备用。标准溶液的制备：准确称取1 g乳酸至100 mL容量瓶中，超纯水溶解并定容至100 mL，该溶液为10000 mg/L 标准样品母液，后将其分别稀释至1000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、50 mg/L、25 mg/L，测定后制作标准曲线。黄水样品前处理：黄水中含有大量的大分子物质如还原糖、淀粉、蛋白质等,以及部分固形物、微生物等，这类杂质若不除去会对色谱柱产生不可逆的影响，因此进样前需进行除杂。用9倍体积甲醇沉淀黄水中蛋白质等大分子物质，振荡 5 min，14000 r/min离心5 min取上清液，上清液稀释到适当倍数后0.2 m滤膜过滤，待上机分析。色谱条件：VenusilASB C18色谱柱（4.6250 mm5 m）；流动相：0.12%H3PO4溶液，0.2 m滤膜过滤，流动相流速 1 mL/min；检测波长 214 nm，柱温箱30，进样量10 L。2结果与分析2.1乳酸色谱定性分析取适量乳酸标准样品母液用0.12%磷酸溶液稀释至1000 mg/L，按照1.2中的前处理方法处理黄水样品，检测对比两样品以进行乳酸峰的定性分析。标准样品和黄水样品色谱检测分析结果见图1和图2。从图1可以看出，乳酸标准品及黄水样品色谱图中乳酸保留时间一致，分别为4.979 min和4.976 min，黄水样品乳酸峰与乙酸峰分离度较好，判定该方法满足测量需求。2.2标准曲线的建立以2.2中5个标准样品浓度梯度作定量分析，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度（mg/L）X为横坐标进行线性回归，检测结果见表1，线性关系见图3。从表1和图3得出以下结论：在251000 mg/L范围内，乳酸浓度与峰面积的比值呈线性关系，回归方程式为Y=0.2657X-0.0613,相关系数R2=1。2.3精密度实验对同一黄水样品和1000 mg/L标准样品进行精密度试验，在重复性条件下获得平行测定结果的相图1乳酸标准样品液相色谱图图2黄水样品液相色谱图132132对标准偏差（RSD值），评价其方法的重现性。验证结果如表2所示：在重复性条件下平行测定的标准样品和黄水样品的RSD值分别为0.04%、0.74%、0.03%和0.52%，精密度符合方法学的要求。2.4加标回收率取白酒黄水样品，一份经 1.2中前处理方法处理后，作为空白样品及本底值，另外3份分别加入10000 mg/L、15000 mg/L、20000 mg/L 乳酸标准溶液，再经 1.2 中前处理方法处理后，进行回收率测定。检测结果见表3。从表3可以看出，在黄水样品中加入已知浓度的乳酸标准品的回收率较好，低、中、高浓度的回收率分别为 101.14%、89.47%和 91.38%，满足回收率的要求。3结论本研究建立了用高效液相色谱快速检测黄水中乳酸含量的分析方法。黄水经过甲醇除杂前处理稀释过滤并直接进样，等度洗脱分析，乳酸出峰时间保持在5 min左右；在251000 mg/L范围内，有 较 好 的 线 性 关 系，R2为 1，加 标 回 收 率 为89.47%101.14%，检出限为 1.15 mg/L，定量限为3.83 mg/L。该方法前处理用甲醇沉淀黄水中的蛋白质、纤维素等大分子物质可以保持样品的纯度，同时保证色谱柱不被污染，延长其寿命，适用于黄水中乳酸的分析检测。参考文献：1林秋萍,李瑾,冯书惠,等.挥发性脂肪酸和乳酸的测定方法研究J.饲料工业,2006(15)：32-33.2范文来.白酒及其发酵过程中内源产生的不挥发性有机化合物综述J.酿酒,2020,47(6)：4-14.3程劲松,胡国栋.填充柱气相色谱法直接进样分析白酒中的乳酸和脂肪酸含量J.酿酒科技,2002(2)：77-78.4张宝玉,李良,吴昊.高效液相色谱法测定酒醅中的乳酸含量J.酿酒科技,2019(2)：109-112.5龙梅.食品中乳酸分析方法研究J.赤峰学院学报：自然科学版,2012(1)：26-29.6凌希利,张水华.比色法测定白酒中乳酸含量J.酿酒科技,1983(2)：19-21.7梅婕,郑东影,司冠儒,等.高效液相色谱法测定黄水中的乳酸J.酿酒,2020,47(5)：42-47.8马金同,沈小梅.超高效液相色谱法测定黄浆水中乳酸的含量J.酿酒,2020,47(5)：71-73.表1不同浓度的标准样品峰面积浓度(mg/L)25502505001000峰面积(mAU)6.713.266.3132.7265.7图3乳酸标准曲线表2精密度实验样品标准样品黄水样品参数保留时间(min)峰面积(AUS)保留时间(min)峰面积(AUS)平行14.979265.514.97659.00平行24.975263.484.97858.91平行34.976261.624.97559.48平均值标准偏差4.9770.002263.541.954.9760.00259.130.31RSD(%)0.040.740.030.52表3黄水中乳酸回收率样品乳酸量（mg/L）22228.5722228.5722228.57加入标品量（mg/L）100001500020000最终测定量(mg/L)平行133030.2238487.5042251.15平行232028.3731675.3136605.68平行334625.2135285.442835.48平行431745.6736392.3539486.39平行530285.2736401.2941345.68加标回收率（%）101.1489.4791.38李隆淼，李杨华，廖勤俭，胡娇，安明哲，罗珠 黄水中乳酸检测方法的研究开发133133