Tspan1通过诱导细胞自...利铂诱导的结直肠癌细胞凋亡_李孝平.pdf
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1、实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9doi:10.3969/j.issn.10065725.2023.09.002项目基金:武汉市医学科研项目(编号:WX20D26)通信作者:李伟Email:Tspan1通过诱导细胞自噬拮抗奥沙利铂诱导的结直肠癌细胞凋亡李孝平周红见高芳芳李伟武汉市第三医院肝胆胰甲状腺胃肠外科(武汉 430047)【摘要】目的探讨四次跨膜蛋白 1(Tspan1)过表达对奥沙利铂(OXA)诱导的人结直肠癌细胞系HCT116细胞凋亡的影响并分析其可能作用机制。方法将Tspan1过表达质
2、粒及其阴性对照空载质粒分别转染至 HCT116 细胞中,qRTPCR 和 Western blot 法检测胞中 Tspan1 mRNA 及其蛋白表达水平。采用14.15 g/mL OXA或联合5 mmol/L自噬抑制剂3MA干预转染后HCT116细胞,MTT检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡水平;免疫荧光检测细胞中LC3B蛋白表达情况;Western blot法检测细胞中自噬相关蛋白 LC3、Beclin1 和 p62 蛋白表达水平。结果Tspan1 过表达可显著上调 HCT116 细胞中 Tspan1mRNA和蛋白表达水平,降低HCT116细胞对OXA的敏感性,抑制OXA诱导的HCT1
3、16细胞凋亡,并增强细胞中LC3B蛋白荧光强度,上调细胞中LC3II/LC3I比值及Beclin1蛋白表达水平,下调p62蛋白表达水平。然而,联合3MA处理可逆转Tspan1过表达对OXA诱导HCT116细胞凋亡的抑制作用,提高细胞对OXA的敏感性。结论Tspan1过表达可拮抗OXA诱导的HCT116细胞凋亡,其机制可能是通过诱导细胞自噬来实现的。【关键词】结直肠癌;四次跨膜蛋白1;奥沙利铂;自噬;凋亡【中图分类号】R735.34Tspan1 antagonizes oxaliplatininduced apoptosis in colorectal cancer cells by induc
4、ing cellular autophagyLI Xiaoping,ZHOU Hongjian,GAO Fangfang,LI Wei.Department of Hepatobiliary Pancreatic Thyroid Gastrointestinal Surgery,Wuhan 430074,ChinaCorresponding author:LI WeiEmail:【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of tetraspanin 1(Tspan1)overexpression on oxaliplatin(OXA)induce
5、d apoptosis in human colorectal cancer cell line HCT116 and to analyze its possible mechanism ofaction.MethodsHCT116 cells were transfected with Tspan1 overexpression plasmid and its negative control vector plasmid.The expression levels of Tspan1 mRNA and protein were detected by qRTPCR and Western
6、blot.Thetransfected HCT116 cells were treated with 14.15 g/mL OXA or combined with 5 mmol/L autophagy inhibitor 3MA.MTT assay was used to detect cell proliferation.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis.The expression of LC3B protein was detected by immunofluorescence.The expression levels
7、 of autophagyrelated proteins LC3,Beclin1 and P62 were detected by Western blot.ResultsOverexpression of Tspan1 significantly upregulatedTspan1 mRNA and protein expression levels in HCT116 cells,reduced the sensitivity of HCT116 cells to OXA,inhibited OXAinduced apoptosis of HCT116 cells,and enhance
8、d the fluorescence intensity of LC3B protein,upregulated the protein expression level of Beclin1 and the ratio of LC3II/LC3I,downregulated the protein expressionlevel of p62,and antagonized the induction of apoptosis by OXA.However,combined treatment with 3MA reversed the inhibitory effect of Tspan1
9、 overexpression on OXAinduced apoptosis of HCT116 cells,and increasedthe sensitivity of cells to OXA.ConclusionOverexpression of Tspan1 antagonizes OXAinduced apoptosis inHCT116 cells by a mechanism that may be mediated through the induction of cellular autophagy.【Key words】colorectal cancer;tetrasp
10、anin 1;oxaliplatin;autophagy;apoptosis基 础 研 究结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率逐年增加,目前已成为我国患病率第二高的恶性肿瘤,对我国居民的生命健康造成了日益严重的影响13。目前,奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)作为铂类化疗药的一种,常用于临床治疗CRC,但同时OXA的长期使用会导致肿瘤产生耐药性4。因此,研究肿瘤化疗耐药的机制意义重大。肿瘤耐药性的产生是一个复杂的过程,往往与细胞功能异常有关,如细胞自噬5。细胞自噬水平的变化不仅影响着肿瘤增1072实用医学杂志2023年第39
11、卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9殖、转移以及凋亡等进程67,而且自噬水平升高可增强肿瘤细胞对化疗药物的耐受性,从而降低化疗药物的药效89。四次跨膜蛋白1(Tetraspanin1,Tspan1)属于四聚体蛋白,其表达水平与多种肿瘤发生发展关系密切1011。WU 等12研究发现,Tspan1 在乳腺癌组织和细胞系中均高度表达,敲低Tspan1表达可抑制乳腺癌细胞生长和转移。此外,已有研究表明,Tspan1在CRC组织中高表达,并与患者远端转移、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期等病理特征显著相关13。然而,Tspan1 表达
12、水平与CRC细胞自噬以及化疗耐药的关系目前尚未见报道。因此,为探讨Tspan1对CRC细胞自噬和化疗耐药的影响,本研究以化疗药物OXA联合自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3methyladenine,3MA)体外干预转染Tspan1过表达质粒后的人结直肠癌HCT116细胞,探究Tspan1高表达水平在化疗药物OXA 干预下对细胞自噬和凋亡的影响,以期为CRC的治疗提供新的方向。1材料与方法1.1材料人结直肠癌细胞系HCT116购自中国典型培养物保藏中心细胞库。McCOYs 5A培养基、Opti MEM培养基、优质胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;Tspan1基因过表达质粒(oeTspan1)及
13、其阴性对照空载质粒(Vector)由上海和元生物技术有限公司提供;LipofectamineTM3000转染试剂购自美国 Thermo 公司;OXA、3MA 购自美国 MCE公司;Cell Counting Kit8(CCK8试剂盒)、AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;LC3B抗体购自美国CST公司;LC3抗体、Beclin1抗体、p62抗体和GAPDH抗体购自美国Affinity 公司;异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗、辣根过氧化物酶(Horserad
14、ish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔或小鼠IgG二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。1.2方法1.2.1细胞培养HCT116 细胞使用含 10%胎牛血清的 McCOYs 5A 培养基培养,置于 37、5%CO2恒温恒湿培养箱中,细胞密度生长至80%以上时,弃培养基,加入 PBS 清洗,使用胰蛋白酶消化传代,待细胞扩增完成,收集对数期细胞用于实验。1.2.2细胞转染收集对数期HCT116细胞,用新鲜完全培养基重悬细胞并调整细胞浓度至2 105个/mL,细胞悬液以2 mL/孔接种至6孔板中,置于培养箱中过夜。实验分为 3 组:空白对照(blank)组,不作任何处理;空载(Vector
15、)组,转染阴性对照空载质粒;Tspan1 过表达(oeTspan1)组,转染Tspan1过表达质粒。oeTspan1和Vector质粒使用LipofectamineTM3000 联合 Opti MEM 培养基转入细胞,4 h后更换新鲜培养基,48 h后收集细胞,采用下述qRTPCR和Western blot法检测Tspan1 mRNA和蛋白表达水平。1.2.3MTT 检测细胞增殖活性取对数生长期各组转染后的HCT116细胞,用新鲜完全培养基重悬细胞并调整细胞浓度至2 104个/mL,细胞悬液以 100 L/孔接种至 96 孔板中,置于培养箱中过夜,加入不同浓度(0、7.81、15.62、31.
16、24、62.5、125、250 g/mL)OXA,另设空白调零组(不接种细胞),孵育48 h。提前4 h向每孔中加入20 L MTT工作液(5 g/L),置于培养箱中避光继续培养。孵育时间结束后,弃培养液,每孔加入 150 L 二甲基亚砜,置于低速摇床上避光振荡10 min,采用酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值,计算细胞增殖活性和 IC50值。细胞增殖活性=(OD 实验组OD 调零组)/(OD对照组OD调零组)100%。1.2.4实验分组及处理根据实验需要进行如下分组和处理,即(1)Vector组:将Vector质粒转染至HCT116细胞中,不经任何药物干预;(2)oeTspan1组:
17、将oeTspan1质粒转染至HCT116细胞中,不经任何药物干预;(3)Vector+OXA 组:将 Vector 质粒转染至 HCT116 细胞中,并采用 14.15 g/mL OXA处理 48 h;(4)oeTspan1+OXA 组:将 oeTspan1 质粒转染至 HCT116 细胞中,并采用 14.15 g/mLOXA处理48 h;(5)Vector+3MA+OXA组:将Vector质粒转染至 HCT116 细胞中,先采用 5 mmol/L 3MA预处理2 h,再采用14.15 g/mL OXA处理48 h;(6)oeTspan1+3MA+OXA 组:将oeTspan1质粒转染至 HC
18、T116 细胞中,先采用 5 mmol/L 3MA 预处理2 h,再采用14.15 g/mL OXA处理48 h。1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡水平按照1.2.4中进行实验分组和药物干预,采用0.25%胰酶消化细胞 1 min,收集细胞,加入 500 L PBS 重悬细胞并调整细胞浓度至2 105个/mL,加入5 L Annexin VFITC工作液和5 L 碘化丙啶工作液,避光孵育15 min,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.2.6免疫荧光检测细胞中LC3B表达情况按1.2.4 进行实验分组和药物干预,弃培养液,加入4%多聚甲醛溶液室温固定10 min,PBS洗3次,加入 0.2%Tri
19、ton X100 室温孵育 10 min,PBS 洗 3次,加入5%山羊血清室温孵育1 h,加入LC3B一抗(1200稀释),4 过夜,PBS洗3次,加入FITC标记的山羊抗兔IgG二抗,室温避光孵育1 h,PBS1073实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9洗3次,加入含DPAI的抗荧光衰减封片剂,室温避光孵育10 min,用荧光显微镜观察并拍照记录LC3B表达情况,并使用软件Imagepro plus分析照片光密度值并计算荧光强度。荧光强度=光密度值/荧光面积。1.2.7qRTPCR 检测细胞中
20、Tspan1 mRNA 表达水平收集 1.2.2 中经转染后的各组 HCT116 细胞,加入裂解液提取总 RNA,酶标仪鉴定 RNA 纯度,采用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,采用 PCR 检测试剂盒进行 qRTPCR 反应。以 GAPDH 为内参,采用 2-Ct法检测转染后各组细胞中Tspan1 mRNA表达水平,引物序列见表1。1.2.8Western blot 检测细胞中 Tspan1、LC3、Beclin1 和 p62 蛋白表达水平按 1.2.2 和 1.2.4 项下实验分组处理细胞,处理结束后离心收集细胞,加入含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度检测
21、试剂盒测定总蛋白含量,取40 g蛋白溶液按4 1的比例加入5还原型蛋白上样缓冲液,沸水浴变性 15 min,进行 SDSPAGE电泳,转膜至提前用甲醇活化后的PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭 1 h。加入 Tspan1 抗体(11 000稀释)、LC3抗体(1 1 000稀释)、Beclin1抗体(1 1 000 稀释)、p62 抗体(1 1 000 稀释)和GAPDH 抗体(1 5 000 稀释),4 孵育过夜,使用PBST清洗3次,加入HPR标记的山羊抗兔或小鼠IgG二抗(1 2 000稀释),室温孵育1 h,PBST清洗3次,加入ECL显影液,化学发光成像仪曝光显影,使用Image J 软
22、件分析蛋白条带值。以GAPDH 为内参,计算 Tspan1、LC3、Beclin1 和 p62 蛋白相对表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带值/GAPDH条带值。1.3统计学方法采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析,计量数据以(xs)表示。两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,事后组内两两比较采用LSDt检验。以P 0.05);与 Vector 组比较,oeTspan1 组细胞中 Tspan1 表达水平显著升高(P 0.05);与Vector组比较,oeTspan1组细胞中Tspan1表达水平显著升高(P 0.05)。表1引物序列Tab.1Primer sequ
23、ences项目Tspan1GAPDH序列(53)F:ACCAAAAAGTAGAGGGTTGCTR:GTGCCTCTTCACAGTTCCCAF:ATGGGCAGCCGTTAGGAAAGR:AGGAAAAGCATCACCCGGAG注:A,qRTPCR检测HCT116细胞中Tspan1 mRNA表达水平;B,Western blot 检测HCT116细胞中Tspan1蛋白表达水平。与blank组或Vector组比较,*P 0.05);与 Vector 组比较,e1074实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.
24、9Tspan1组细胞增殖活性显著升高(P 0.05),提示Tspan1 过表达可促进 HCT116 细胞增殖。不同浓度(0、7.81、15.62、31.24、62.5、125、250 g/mL)OXA 处理细胞 48 h 后,blank 组、Vector 组和 oeTspan1 组细胞增殖活性均显著降低(P 0.05),IC50值分别为(19.760.58)、(19.740.63)、(52.562.21)g/mL;与 blank 组比较,Vector 组细胞 IC50值无显著变化;与Vector组比较,eTspan1组细胞IC50值显著升高,提示 Tspan1 过表达可拮抗 OXA 对HCT1
25、16 细胞的增殖抑制作用,选择 blank 组细胞IC40值14.15 g/mL作为后续实验干预浓度。2.3Tspan1 过表达对 OXA 诱导 HCT116 细胞凋亡的影响流式凋亡结果(图3)显示,与Vector组比较,oeTspan1 组细胞凋亡率显著降低(P 0.05),Vector+OXA 组细胞凋亡率显著升高(P 0.05);与Vector+OXA组比较,oeTspan1+OXA组细胞凋亡率降低(P 0.05)。注:与Vector组比较,*P 0.05图2OXA对Tspan1过表达后HCT116细胞增殖活性的影响Fig.2Effect of OXA on proliferation
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