waters色谱柱相关知识-医学课件.ppt
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1、对对HPLC柱填料的了解柱填料的了解平均颗粒度,颗粒度分布.颗粒度(dp)颗粒度越小:柱效越高(传质好,涡流扩散小)柱压越高(渗透性差).颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差).颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型:柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展对对HPLC柱填料的了解(二)柱填料的了解(二)平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布.大的孔径可分析高分子量的分子对对HPLC柱填料的了解(三)柱填料的了解(三)键合相化学.影响化合物的分离度:a.不同键合相对不同种类的化合物分离不同.可能导致色谱的分离机理不同.如:C18、C8、CN硅胶表面及键合相硅胶表面及键合相键合相色谱柱
2、键合相色谱柱以硅胶为基质,通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上,作为固定相。优点.固定相稳定,不易流失.应用广泛,可使用多种溶剂.消除硅羟基的不良影响缺点.pH值不能小于3.同样填料,各种牌号色谱柱不尽相同对对HPLC柱填料的了解(四)柱填料的了解(四)含碳量含碳量越高,k值越大(固定相传质效应增加).高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好,重现性好有利于极性化合物的拖尾改善.低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗不同色谱柱的含碳量不同色谱柱的含碳量 色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱C%C%k k苊苊苊苊 (50/50(50/50的乙腈的乙腈的乙腈的乙腈/水水水水)S
3、ymmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0Bondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5对对HPLC柱填料的了解柱填料的了解(五五)填料的端基封口.封口残余硅羟基.减少不可逆吸附或拖尾.增加碳含量(0.1%-1%)残基处理的效果残基处理的效果NovaPak C18未封口 C18 抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺对对HPLC
4、柱填料的了解(六)柱填料的了解(六)硅胶的活性.主要影响碱性化合物的保留行为:k.生产硅胶时处理温度不同,硅胶活性也不同.是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量.重金属含量低,硅羟基活性小,拖尾减小.是色谱柱质量好坏的重要标志对对HPLC柱填料的了解(七)柱填料的了解(七)填料的稳定性.硅胶填料.pH:2-8聚合物填料.pH:2-12.pH值小于2时键合相水解填料基质物理性质的影响填料基质物理性质的影响所有C18柱都是相同的吗?填料基质的物理性质对色谱柱的影响.平均孔径及其分布影响被分析样品的分子量,大孔径的可分析高分子量样品.平均孔体积及其分布影响同孔径.含碳量影响化合物的保留时间,高含碳量保
5、留时间长.填料的端基封口主要影响碱性化合物的峰形,未封口会使碱性化合物拖尾.硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为:K,高活性的K大.硅胶的杂质含量更苛刻条件下的碱性化合物峰形Waters色谱柱的内径色谱柱的内径分析柱:Waters Spherisorb及其它公司品牌的色谱柱多为4.6mm内径。Waters传统品牌的分析柱以3.9mm内径为主,比一般分析柱(4.6mm)细,因此:.相对灵敏度高.省溶剂,可用相对较低的流速.同样的流速下,柱压较高(高效柱尤为明显)注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持线速度相同。色谱柱化学及外形结构的关系色谱柱化学及外形结构的关系对对HPLC柱的了解柱
6、的了解理论塔板数(N),容量因子(K),选择性系数(),其影响因素有.N:受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗 粒度越小,N越高.:受填料表面化学性质对色谱柱的影响,不同键合相对不同种类样品分离不同.K:受键合相表面含碳量的影响,含碳量高 时保留时间长在同样情况下保留行为也有差异在同样情况下保留行为也有差异因此:.需要对色谱化学品(色谱柱)有更多的了解.需要不同品牌,即各个因素有较大差异的色谱柱,以得到更多种选择性Waters拥有众多不同品牌的色谱柱,目的就是:供不同应用的要求用不同品牌的色谱柱时,色谱方法有时可能需要重新开发Waters各种硅胶基质的色谱柱各种硅胶基质的色谱柱Waters不同品
7、牌的色谱柱不同品牌的色谱柱-BondaPak.文献背景强,是工业标准.平均孔径125,10m高活性、无定形硅胶.中等疏水性表面,端基封口。有独特选择性Nova-Pak.平均孔径60,4m高韧度低活性球形硅胶.低酸性,高疏水性,极好的端基封口.有利于小分子物质的分析Waters不同品牌的色谱柱不同品牌的色谱柱Resolve.平均孔径90,5/10 m低活性硅胶.非常高的疏水性,无端基封口.有利于低保留的中性及酸性化合物分离Delta-Pak.有100和300两种孔径,5/15 m硅胶.中到高的疏水性,端基封口.适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱新一代硅胶基质的色谱柱新一代硅胶基质的色谱柱 Symm
8、etry.高纯度硅胶:Fe,Al,Mg等均85%)2提取板及小柱可获得一致的回收率(RSDs5%)3容易使用Oasis HLB 固相提取小柱C18与Oasis HLB 吸附剂浸润能力的比较H L HLHLHLHLHLLLLLLLLL LLLL HLBH=亲水单元L=亲脂单元C18特征二,通用型吸附剂4优势:l在很宽极性范围内保留酸性、碱性及中性化合物l样品不会穿透小柱4益处:l对极性化合物可获得较高回收率l使用同一方法,提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率l一种吸附剂适用于大多数SPE提取过程Oasis HLB固相提取小柱结果:通用型吸附剂020406080100AcidsNeu
9、tralsBases%回收率Ibuprofen(2.5?g)Naproxen(2?g)SalicylicAcid(5?g)Sulfadiazine(10?g)Sulfamerazine(10?g)Acetaminophen(0.5?g)Theobromine(0.5?g)Paraxanthine(0.5?g)Theophylline(0.5?g)Caffeine(0.5?g)Procainamide(0.5?g)Ranitidine(0.5?g)Oxycodone(1?g)Propranolol(4?g)Naltrexone(1?g)Salbutamol(2?g)Doxepin(4?g)Spi
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