免疫组化染色的常见问题和定量分析课件.ppt
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1、文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。免疫组化原理和方法免疫组化原理和方法定义:组织化学HistochemistryDealing with identification of chemical components in cells and tissues.文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。概念:利用已知的特异性抗体与抗原能特异性结合这一特点,通过化学反应,使标记于特异性抗体上的显示剂显色,从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构,了解抗原表达情况的一门组化技术。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有
2、不当之处,请联系网站或本人删除。原理:利用抗原抗体能够特异性结合这一原理,从而在组织细胞水平进行抗原抗体反应。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。一抗的类别n蛋白质n肽类n酶类n激素类n糖类n脂质类抗原 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。显示剂 n酶n金属离子n同位素 n荧光分子文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。底物底物 DAB(3,3-二胺基联苯胺)AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑)坚牢蓝 核固红文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或
3、本人删除。免疫组化的优点 n特异性强:抗原与抗体的“一对一”的特异结合,仅当组织细胞中存在交叉抗原时会出现交叉反应。n敏感性高 n定位准确、形态与功能相结合 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。免疫组化技术操作上的优点n方法简单,易掌握n在组织切片原位显示抗原的表达情况n试验条件要求不高,绝大多数实验室都可满足其需要。n不需要特殊、贵重的仪器。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。免疫组化染色的缺点n为半定量分析,不能进行定量分析。n受实验者技术水平影响较大。n结果判定主观性较强。文档仅供参考,不能作为科学依据,
4、请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。步骤n二甲苯脱蜡 302n梯度酒精复水(100%2,95%,90%,85%,每次5,蒸馏水)n双氧水阻断非特异性过氧化物酶(0.3%-3%)n抗原修复(酶,微波,高压锅)n二抗同种属血清封闭抗原非特异性表达(BSA,山羊血清)n一抗4过夜n复温n二抗nDAB显色n苏木素复染,盐酸酒精分色,流水返蓝n脱水、透明,中性树胶封片文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。染色中各步骤注意事项及原理n前期处理n染色n后期处理文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。前期 n不可控制因素:
5、取材、固定、脱水、透明、浸蜡,包埋n可控制因素:捞片:注意不要太靠近一侧,必要时用镊子压住组织片控水 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。染色过程中的影响因素n阻断非特异性过氧化物酶n抗原修复n封闭抗原非特异性表达n一抗n二抗nDAB显色文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。内源性内源性HRP的消除的消除 分布:脑,脾,中性WBC,巨噬细胞。血红蛋白和肌红蛋白含有铁卟啉具有内源 性HRP活性文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。内源性内源性HRP的消除的消除:3%H2O2,
6、5-100.3%H2O2甲醇溶液,15-600.1%HCl 酒精溶液,300.2%醋酸甲醇溶液,300.01%过碘酸 5-10,0.1%硼酸钠 10文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。抗原修复 n甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定簇n甲醛在保存进程中会形成羧甲基,而封闭抗原决定簇n在用固定剂固定时,会使蛋白与蛋白之间发生交联,也可能会封闭抗原决定簇 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。抗原修复方法 n化学方法n物理化学方法文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。化学
7、方法一.胰蛋白酶(tyrpsin)消化方法:1.配制:取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1,PH78的无水氯化钙水溶液中,溶解即可用。2.消化条件和时间:将切片放置在湿盒内,3710一40min,一般为20 min即可。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法 1.配制:0.4胃蛋白酶,用0.1mol/L的Hcl配制。2.消化时间:3720 min。3.用途:主要用于细胞间质抗原的显示,如纤粘素、胶原酶等 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。三链霉蛋
8、白酶消化方法 四无花果蛋白酶消化方法 五.菠萝蛋白酶消化方法 六尿素消化方法 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。物理化学方法 n单纯加热方法:将片子放入盛有抗原修复液的容器中,置电护上加热至沸腾,并持续10min。n微波方法:将片子放入盛有抗原修复液的容器中,置微波炉加热使温度保持在92100。总时间10min,但必须有间隔。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。高压锅免疫组化抗原修复程序高压锅免疫组化抗原修复程序n切片放在 染色架上(不宜太密)n高压锅加入0.01M 枸橼酸钠缓冲液3L,染色放在枸橼酸钠缓冲液
9、内,加盖,煮沸,冒气后,加上限压阀加压1-5(通常选择2分钟)n晾凉取出文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。柠核酸盐缓冲液的配制 nA液:称取2101g柠檬酸溶于1000 ml蒸馏水中。nB液:称取2941g柠檬酸钠溶于1000 ml蒸馏水中。n工作液:取9mlA液和41 mlB液,加入450 ml蒸馏水,调PH6.0士0.1。抗体的保存和配制文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。抗体的保存抗体的保存*分装,低温,避免反复冻融*硅化,防止蛋白吸附*防止交叉污染和细菌污染文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如
10、有不当之处,请联系网站或本人删除。分装 n按5l或10 l分装,并注明标记(批号、名称、效价、量),密封。故入-20一-40冰箱中保存备用,一般可保存12年。nPBS稀释的抗体不能长时间保存,在4可放13天,超过7天效价显著降低。n避免反复冻融而使抗体效价降低 文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。即用型抗体 一般4保存效价稳定在一年以上文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。抗体的配制 n根据说明书推荐浓度,进行倍比稀释n自制抗体根据酶标结果,进行倍比稀释。n最好采用抗体稀释液进行稀释,如无抗体稀释液,可采用PBS
11、进行稀释。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。其他准备工作中的注意事项n盖玻片需过酸3-5分钟,流水冲洗1小时以上n 盖玻片的储存:浸泡于95-100%的Alc中,随用随擦,注意冲洗好的盖玻片呈无色或淡蓝色,如发黄请重新冲洗干净。n 用废白衣擦盖玻片效果较好n 配制缓冲液n 注意桌面和湿盒的情况,如不平可用纸 垫平文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。免疫组化染色不理想的处理免疫组化染色不理想的处理文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模
12、仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。非特异性染色的消除非特异性染色的消除最大限度稀释抗体文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。修改封闭方法*二抗同种属正常血清阻断,很多背景染色深的原因是正常动物血清使用不合理,如第二抗体为羊抗鼠IgG,应该用羊的正常血清。*羊血清*BSA阻断*羊血清+BSA*5%脱脂奶文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。DAB显色过程中的
13、问题nDAB显色:一般2-5分钟,最多不要超过10分钟nDAB显色过快,少于一分钟时,注意一次显色的片子不要超过5张。n注意DAB渣子的问题,配好的DAB显色液应为清亮,微带烟色,如看到颗粒样物或呈棕色,应予以过滤文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。抗原的“例外”表达 细胞的分化不同阶段其抗原性有相应变更,可解释这些抗原的“例外”表达。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。出现背景着色的其他几种原因 n内源性过氧化物酶没有完全阻断。n脱蜡不够彻底。n组织粘贴剂使用不当或太浓。nPBS冲洗不够。n抗体稀释不合理,浓
14、度太高n底物显色时间太长。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。染色背景过深的处理n采用不同的封闭方法,直至5%的脱脂奶。n梯度稀释一抗,降低一抗浓度,选择最适的抗体稀释度。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。特异性差的处理n选择相应比较合适的抗体稀释度,延长一抗4孵育时间,必要时可以采用4 2-3天。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。假阳性的原因 n抗体与多种抗原有交叉反应n抗体与组织中某些成分的非特异性结合 n内源性酶的显色n肿瘤或病变中有其他组织残留,尤其是肿瘤中
15、残余极少的正常组织,而正常组织此时又有一定程度的增生或萎缩时,易将其误认为肿瘤成分n抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原在不该出现的部位出现,如何杰金病Rs细胞中的免疫球蛋白n异位抗原的表达,文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿模仿;如有不当之处,请联系网站或本人删除。假阴性的原因 n(1)抗体己失活、浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度,不论是自产抗体、国外赠送的抗体还是商品化的抗体,都会有抗体不能显示相应抗原的现象n(2)抗原丢失或减弱,当标本处理不当时更容易出现,如固定不良、温度过高n(3)操作步骤不当,即纯技术上的失误,如反应时间不够或过久、洗脱不够等。文档仅供参考,不能作为科学依据,请勿
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