PCR技术的原理操作及应用-医学课件.ppt
《PCR技术的原理操作及应用-医学课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《PCR技术的原理操作及应用-医学课件.ppt(32页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、什么是什么是PCRPCR:Polymerasechainreaction,即聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术PCR技术的发展历史技术的发展历史1985关于PCR的文章首次由美国科学家1986KaryMullis等人在Science杂志上发表1989Science杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶(生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶)的发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理技术的原理 1遗传物质:细胞核染色体D
2、NA(脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基(A、T、C、G)是按双链螺旋排列的,碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对,按上述的0.1%的差,人和人之间有3百万个碱基对的差别。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR技术的原理技术的原理 2PCR反应的基本成分包括7种基本成分:模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子基本反应步骤:变性-退火-延伸最后通
3、过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出PCR技术的原理技术的原理 31234522557294时间(min)温度()适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍RT-PCR的原理的原理 相对于PCR,在开始阶段增加步骤:RNAcDNA合成,是单链到双链的过程。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 1 实时荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未
4、知模板进行定量分析的方法。常用的荧光定量PCR试剂:SYBRGreenITaqman水解探针实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 2基线(Baseline)是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。光阈值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。CT(Cyclethreshold)值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越
5、多,CT值越小,反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 3Ct与初始模板的关系固定循环数后,荧光信号与模板数成正比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系,根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量阈值阈值104103102PCR技术的优点技术的优点优点:特异敏感快速、简便易自动化等PCR技术的局限性技术的局限性为了构建特定引物,使特定DNA序列的选择性扩增,必
6、须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大,根据不同的因素需要优化反应条件。PCR技术扩增产物的长度有限。PCR技术的注意事项技术的注意事项防止污染,建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生,特别注意阳性样品的拿放,使用一次性耗材,穿戴手套并经常更换,永远在最后一步才加核酸,液体分装使用等。引物设计合理Taq酶扩增错误率较高,大约1/100对碱基/20个循环镁离子浓度对反应效率的影响仪器稳定性,升降温速率,管子的密合度等RT-PCR注意防止RNA降解PCR技术的操作技术的操作 1以流感病毒的RT-PCR和Real-timeRT-PCR检测为例说明PCR技术的操作步骤主要仪器:PC
7、R仪,Real-timePCR仪,微量移液器,高速冷冻离心机,电泳仪和电泳槽,凝胶电泳观察仪或成像系统,生物安全柜等。PCR技术的操作技术的操作 21.病毒核酸RNA提取2.RT-PCR反应或者Real-timeRT-PCR反应3.UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果流感病毒核酸提取流感病毒核酸提取 1试验材料QIAGEN公司的RneasyMiniKit(或QIAGEN公司的QIAmpViralRNAMiniKit,操作类似)-巯基乙醇(-mercaptoethanol)70%乙醇无菌及DNA,RNA酶的1.5ml离心管10l、20l、200l、1000l加样器和枪头可调13K微型冷冻离心机待
8、检流感病毒200l流感病毒核酸提取流感病毒核酸提取 21、取采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)200ul加在1.5mlEppendorf管中2、依次加入350ulRLT液、3.5ul-巯基乙醇和70%的乙醇550ul混匀3、将Rneasyminispin柱子置于干净的2ml收集管上,将2步骤的混合液600ul吸出加入柱子中,12,000rpm,离心15秒,弃收集管中的离心液4、柱子仍放回收集管上,将2步骤剩余的混合液全部吸到柱子上,12,000rpm,离心15秒,弃离心液5、于柱子中加入700ulWashBufferRW1液,12,000rpm,离心15秒6
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- PCR 技术 原理 操作 应用 医学 课件
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【w****g】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【w****g】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。